He ma'i lele 'o COVID-19 e ka Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Type 2. I ka loa'a 'ana o ke kanaka i ka ma'i, 'o ka ma'i ma'amau ka ma'i kuni, ka 'u'u, a me ka pōkole hanu.

Hiki ke hōʻiliʻili ʻia nā laʻana i hoʻohana ʻia no ka hoʻāʻo ʻana e nā swabs nasopharyngeal a i ʻole nā ​​​​ swabs oropharyngeal.

He aha ka PCR?

ʻO ke ala maʻamau o ka ʻike ʻana i ka coronavirus ʻo ka polymerase chain reaction, PCR.He ala kēia i hoʻohana nui ʻia i ka biology molecular.Hiki iā ia ke kope koke i nā miliona a i nā piliona o nā ʻāpana DNA kikoʻī.

Aia ka coronavirus hou i kahi genome RNA lōʻihi loa.I mea e ʻike ai i kēia mau maʻi maʻi e ka PCR, pono e hoʻololi ʻia nā molekala RNA i kā lākou mau kaʻina DNA hoʻohui me ka reverse transcriptase, a laila hiki ke hoʻonui ʻia ka DNA synthesized hou e nā kaʻina PCR maʻamau, i ʻike mau ʻia ʻo RT-PCR.

Kaʻina RT-PCR

RNA unuhi

No ka hana ʻana i kēia ʻano, pono e unuhi ʻia ka RNA viral.Hiki ke hoʻohana ʻia nā ʻāpana hoʻomaʻemaʻe RNA no ka hoʻokaʻawale maʻalahi, wikiwiki a maikaʻi.

No ka unuhi ʻana i ka RNA viral me ka hoʻohana ʻana i kahi pahu pāʻoihana, e hoʻohui mua i ka laʻana i kahi paipu microcentrifuge a laila hui pū me ka lysis buffer.Hoʻopau nui ʻia kēia buffer a loaʻa mau i ka phenol a me guanidine isothiocyanate.Eia kekahi, aia nā mea hoʻopaneʻe RNase i ka lysis buffer e hōʻoia i ka hoʻokaʻawale ʻana o ka RNA viral intact.

Ma hope o ka hoʻohui ʻana i ka lysis buffer, vortex i ka paipu hui ʻana me ka pulse a hoʻomoʻa i ka lumi wela.Hoʻopili ʻia ka maʻi ma lalo o nā kūlana denaturing nui i hāʻawi ʻia e ka lysis buffer.

Ma hope o ka hoʻoheheʻe ʻia ʻana o ka hāpana, hoʻohana ʻia kahi pahu centrifuge no ka hana hoʻomaʻemaʻe.Hoʻokomo ʻia ka hāpana i loko o ka pahu centrifuge a laila centrifuged.

ʻO kēia kaʻina hana he ʻano hoʻoheheʻe paʻa paʻa i loko o ka pae paʻa i kahi matrix gel silica.

Ma lalo o nā kūlana paʻakai a me ka pH maikaʻi loa, hoʻopaʻa nā molekala RNA i ka membrane silica.

I ka manawa like, wehe ʻia ka protein a me nā mea haumia ʻē aʻe.

Ma hope o ka centrifugation, e hoʻokomo i ka paipu centrifuge i loko o kahi paipu hōʻiliʻili maʻemaʻe, e hoʻolei i ka kānana, a laila hoʻohui i ka pale holoi.

E kau hou i ka paipu i loko o ka centrifuge e hoʻoikaika i ka pale holoi ma o ka membrane.Hoʻopau kēia i nā mea haumia a pau mai ka membrane, e waiho wale ana i ka RNA i paʻa i ka silica gel.

Ma hope o ka holoi ʻia ʻana o ka hāpana, e hoʻokomo i ka paipu i loko o kahi paipu microcentrifuge maʻemaʻe a hoʻohui i ka elution buffer.

A laila ua centrifuged e hoʻoikaika i ka elution buffer ma o ka membrane.Hoʻopau ka elution buffer i ka RNA viral mai ke kolamu spin a loaʻa iā RNA i hoʻomaʻemaʻe ʻia me ka ʻole o nā protein, nā mea hoʻopaneʻe, a me nā mea haumia ʻē aʻe.

KANAWAI 2

Hoʻohui hui

Ma hope o ka unuhi ʻana i ka RNA viral, ʻo ka hana aʻe e hoʻomākaukau i ka hui ʻana no ka hoʻonui PCR.I kēia hana, hoʻohana ʻia ka concentrate.ʻO kēia ʻano hoʻonā i hoʻopaʻa ʻia he ʻano hoʻonā premixed concentrated me kahi premix, reverse transcriptase, nucleotides, forward primer, reverse primer, TaqMan probe a me DNA polymerase.

ʻO ka hope, e hoʻopau i kēia hui ʻana, ua hoʻohui ʻia ka template RNA.Hoʻohui ʻia nā paipu e ka pulse vortexing, a laila hoʻokomo ʻia ka hui ʻana i loko o ka pā PCR.Loaʻa i ka pā PCR nā pūnāwai he 96 a hiki ke nānā i nā laʻana he nui i ka manawa like.

KANAWAI 3

Hoʻonui PCR

A laila, kau i ka pā i loko o ka mīkini PCR, ʻo ia hoʻi he mea hoʻokele wela.

Hoʻohana ʻia ka RT-PCR manawa maoli no ka ʻike ʻana i ka coronavirus novel 2019 ma o ka hoʻonui ʻana i ke kaʻina pahuhopu i ka gene RdrRP, E gene a me N gene.ʻO ke koho ʻana o ka gene i hoʻopaʻa ʻia ma muli o ke kaʻina kumu mua a me ke kaʻina noiʻi.

ʻO ka hana mua o ka RT-PCR ka hoʻololi ʻana.Hoʻokumu ʻia ke kaula mua o ka DNA hoʻohui, i hoʻomaka ʻia e ka PCR reverse primer, kahi e hoʻopaʻa ai i ka ʻāpana hoʻohui o ka genome viral RNA.A laila hoʻohui ka transcriptase i nā nucleotides DNA i ka hopena 3′ o ka primer e synthesize DNA hoʻohui i ka RNA viral.ʻO ka mahana a me ka lōʻihi o kēia kaʻina e pili ana i nā primers, target RNA, a me ka hoʻohuli transcriptase i hoʻohana ʻia.

A laila, hoʻohana ʻia kahi ʻanuʻu denaturation mua, e hopena i ka denaturation o ka RNA-DNA hybrid.Pono kēia ʻanuʻu e hoʻāla i ka DNA polymerase.I ka manawa like, hoʻopau ʻia ka reverse transcriptase.

ʻO ka PCR he pūʻulu o nā pōʻai wela.ʻO kēlā me kēia pōʻai he denaturation, annealing a me nā ʻanuʻu hoʻonui.

ʻO ka hana denaturation e pili ana i ka hoʻomehana ʻana i ke keʻena pane i 95 degere Celsius a me ka hoʻohana ʻana iā ia no ka denaturation o ka hoʻohālike DNA kaulua.

I ka pae aʻe, e hoʻemi ʻia ka wela o ka hopena i 58 degere Celsius, e ʻae ana i ka mua mua e hoʻopili i ka ʻāpana hoʻohui o kāna kumu hoʻohālike DNA.ʻO ka mahana annealing e pili pono ana i ka lōʻihi a me ke ʻano o ka primer.

Ma ka pae hoʻonui, hoʻohui ka DNA polymerase i kahi kaula DNA hou i hoʻohui ʻia i ke kaula hoʻohālike DNA.Ma ka hoʻohui ʻana i nā nuclei manuahi i hoʻohui ʻia i ke kumu hoʻohālike ma ke kuhikuhi 5′a 3′ mai ka hui ʻana.ʻO ka mahana o kēia kaʻina e pili ana i ka DNA polymerase i hoʻohana ʻia.

Ma hope o ka pōʻaiapuni mua, loaʻa kahi pahuhopu DNA kaulua.

A laila, e komo i ka lua o ka pōʻai.Hoʻopaʻa ʻia ka DNA ʻālua ʻelua no ka hana ʻana i ʻelua mau molekole DNA ʻelua.

I ka pae aʻe, ua hoʻohaʻahaʻa ʻia ka wela o ka hopena, ua hoʻopili ʻia nā primers i kēlā me kēia ʻano DNA i hoʻopaʻa ʻia, a ua hoʻopili ʻia ka ʻimi Taq-man i ka ʻāpana hoʻohui o ka DNA target.

Aia ka ʻimi TaqMan i kahi fluorophore i hoʻopili ʻia i ka hopena 5′ o ka ʻimi oligonucleotide.Ke hoʻohauʻoli ʻia e ke kumu māmā o ka mea holo kaʻa, hoʻopuka ka fluorophore i ka fluorescence.Eia kekahi, ua haku ʻia ka ʻimi ʻana i kahi mea hoʻopau ma ka hopena 3′.ʻO ka kokoke o ka gene reporter i ka quencher e pale i ka ʻike ʻana o ka fluorescence.

I ka pae hoʻonui, hoʻohui ka DNA polymerase i kahi kaula hou.Ke hōʻea ka polymerase i ka ʻimi TaqMan, hoʻokaʻawale kāna hana 5′nuclease endogenous i ka ʻimi, e hoʻokaʻawale ana i ke kala mai ka mea kinai.

Me kēlā me kēia pōʻai o ka PCR, ua hoʻokuʻu ʻia nā molekole dye hou aʻe, ka hopena i ka piʻi ʻana o ka nui o ka fluorescence e like me ka nui o nā amplicons synthesized.

Hiki i kēia ʻano ke koho i ka helu o kahi kaʻina i hāʻawi ʻia i loko o ka hāpana.Hoʻopālua ka helu o nā ʻāpana DNA kaulua i kēlā me kēia pōʻai.No laila, hiki ke hoʻohana ʻia ka PCR e kālailai i nā laʻana liʻiliʻi loa.

No ke ana ʻana i ka hōʻailona fluorescent, kukui halogen tungsten, kānana excitation, reflector, lens, kānana hoʻokuʻu a me ka hoʻopiʻi ʻana i nā hāmeʻa-hoʻohana i ka kāmela CCD.

KANAWAI 4 E ike

No ke ana ʻana i ka hōʻailona fluorescent, kukui halogen tungsten, kānana excitation, reflector, lens, kānana hoʻokuʻu a me ka hoʻopiʻi ʻana i nā hāmeʻa-hoʻohana i ka kāmela CCD.

Hōʻike ʻia ke kukui kānana mai ke kukui e ka reflector, hele i ka lens condenser, a ua kālele ʻia i waenakonu o kēlā me kēia puka.A laila, ʻike ʻia ka fluorescence i hoʻokuʻu ʻia mai ka lua mai ke aniani, hele i ka kānana emission, a ʻike ʻia e ka kamera CCD.I kēlā me kēia pōʻaiapili PCR, hiki ke ʻike ʻia ke kukui fluorophore hoʻohiwahiwa iā ia iho e ka CCD.

Hoʻololi ia i ke kukui i hopu ʻia i ʻikepili kikohoʻe.Kapa ʻia kēia ʻano hana PCR manawa maoli, a hiki iā ia ke nānā pono i ka holomua o ka hopena PCR.