Mea hoʻomaka: RNA
ʻO ka quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) kahi ʻano hoʻokolohua i hoʻohana ʻia i nā hoʻokolohua PCR me ka hoʻohana ʻana i ka RNA i mea hoʻomaka.Ma kēia ʻano, ua kākau mua ʻia ka RNA a i ʻole ka messenger RNA (mRNA) i loko o ka DNA hoʻohui (cDNA) e ka reverse transcriptase.Ma hope mai, ua hana ʻia kahi pane qPCR me ka hoʻohana ʻana i ka cDNA ma ke ʻano he hoʻohālike.Ua hoʻohana ʻia ʻo RT-qPCR i nā ʻano noiʻi biology molecular, me ka nānā ʻana i ka huaʻōlelo gene, ka hōʻoia interference RNA, ka hōʻoia microarray, ka ʻike pathogen, ka hoʻāʻo genetic, a me ka noiʻi maʻi.
Hoʻokahi ʻanuʻu a me ʻelua mau ala no RT-qPCR
Hiki ke hoʻokō ʻia ka RT-qPCR ma kahi ʻano hana hoʻokahi a i ʻole ʻelua.Hoʻokahi ʻanuʻu RT-qPCR hoʻohui i ka transcription hoʻohuli a me ka hoʻonui PCR, e ʻae ana i ka reverse transcriptase a me DNA polymerase e hoʻopau i ka hopena i loko o ka paipu hoʻokahi ma lalo o nā kūlana buffer like.Hoʻokahi ʻanuʻu RT-qPCR wale nō e koi i ka hoʻohana ʻana i nā primers kikoʻī kikoʻī.Ma nā ʻanuʻu ʻelua RT-qPCR, hana ʻia ka hoʻololi ʻana a me ka hoʻonui ʻana i ka PCR i ʻelua mau paipu, me ka hoʻohana ʻana i nā buffers i hoʻopaʻa ʻia, nā kūlana pane, a me nā hoʻolālā hoʻolālā mua.
| Pōmaikaʻi | Ka pōʻino | |
| Hoʻokahi ʻanuʻu | ʻAʻole liʻiliʻi ka hewa hoʻokolohua o kēia ʻano hana no ka mea ua hana ʻia nā hopena ʻelua i loko o ka paipu hoʻokahi
ʻO ka liʻiliʻi o nā ʻanuʻu paipu e hōʻemi i ka pilikia o ka haumia
He kūpono no ka hoʻonui / screening kiʻekiʻe, wikiwiki a reproducible | ʻAʻole hiki ke hoʻokaʻawale ʻia nā pane ʻelua ʻanuʻu
Ma muli o ka hoʻopili ʻia ʻana o ke ʻano o ka hopena ma ka hoʻohui ʻana i ka hopena ʻelua ʻanuʻu, ʻaʻole maikaʻi ka naʻau e like me ke ʻano o ke ala ʻelua.
He liʻiliʻi ka helu o nā pahu hopu i ʻike ʻia e kahi laʻana |
| ʻElua ʻanuʻu | Hiki ke hana i nā hale waihona puke cDNA paʻa i hiki ke mālama ʻia no ka manawa lōʻihi a hoʻohana ʻia i nā hopena he nui.
Hiki ke hoʻonui ʻia nā genes a me nā genes kuhikuhi mai ka waihona cDNA like me ka pono ʻole o nā hale waihona cDNA he nui.
ʻO nā pale pale a me nā kūlana pane e hiki ai ke hoʻonui i ka holo ʻana o ka hopena hoʻokahi
ʻO ke koho maʻalahi o nā kūlana hoʻoulu | ʻO ka hoʻohana ʻana i nā paipu he nui, a ʻoi aku ka nui o nā pipetting e hoʻonui ai i ka pilikia o ka haumia DNA, a hoopau manawa.
Pono ʻoi aku ka maikaʻi ma mua o ke ʻano hana hoʻokahi |
Nā huahana pili:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Hoʻokahi Kaʻina)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Hoʻokahi Kaʻina)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix No First-Strand CDNA Synthesis
ʻO ka PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
ʻO ka manawa maoli PCR Easyᵀᴹ-Taqman
Ke koho ʻana i ka huina RNA a me ka mRNA
I ka hoʻolālā ʻana i kahi hoʻokolohua RT-qPCR, he mea nui e hoʻoholo inā e hoʻohana i ka RNA a i ʻole ka mRNA i hoʻomaʻemaʻe ʻia ma ke ʻano he kumu hoʻohālike no ka hoʻololi ʻana.ʻOiai hiki i ka mRNA ke hāʻawi i ka ʻike kiʻekiʻe iki, hoʻohana pinepine ʻia ka RNA āpau.ʻO ke kumu o kēia, ʻoi aku ka nui o ka RNA āpau ma ke ʻano he mea hoʻomaka ma mua o ka mRNA.ʻO ka mea mua, pono ke kaʻina hana i ka liʻiliʻi o ka hoʻomaʻemaʻe ʻana, kahi e hōʻoia ai i ka hoʻihoʻi hou ʻana o ka template a me ka hoʻomaʻamaʻa maikaʻi ʻana o nā hopena i ka hoʻomaka ʻana i nā helu kelepona.ʻO ka lua, pale ia i ka hana hoʻonui mRNA, hiki ke pale i ka hiki ke hoʻololi i nā hopena ma muli o ka hoʻihoʻi hou ʻana o nā mRNA like ʻole.ʻO ka holoʻokoʻa, no ka mea ma ka hapa nui o nā noi ʻoi aku ka nui o ka helu pili o ka gene target ma mua o ka ʻike piha o ka ʻike, ʻoi aku ka maikaʻi o ka RNA āpau i ka nui o nā hihia.
ʻO ke kumu mua transcription hoʻohuli
Ma ke ʻano ʻanuʻu ʻelua, hiki ke hoʻohana ʻia nā ʻano hana ʻokoʻa ʻekolu e hoʻomaka i ka hopena cDNA: oligo(dT) primers, random primers, a i ʻole sequence-specific primers.ʻO ka maʻamau, hoʻohana ʻia nā kumu mua oligo(dT) a me nā primer random.Hoʻopili kēia mau primers i ke kaula mRNA template a hāʻawi i ka transcriptase reverse me kahi hoʻomaka no ka synthesis.
| Koho mua | Ka hale a me ka hana | Pōmaikaʻi | Ka pōʻino |
| Oligo(dT) kumu mua (a i ole oligo (dT) kumu mua) | Hoʻopili ʻia i nā koena o koumine ma ka huelo poly(A) o mRNA;Loaʻa ka kumu mua o ka heleuma oligo(dT) he G, C, a i ʻole A ma ka hopena 3′ (kahi heleuma) | Hoʻohui ʻia o ka cDNA lōʻihi piha mai ka poly(A)-tailed mRNA
Hoʻohana ʻia inā loaʻa nā mea hoʻomaka liʻiliʻi
ʻO ka pae heleuma e hōʻoia i ka hoʻopaʻa ʻana o ka oligo(dT) primer i ka huelo 5′ poly(A) o ka mRNA | He kūpono wale no ka hoʻonui ʻana i nā genes me nā huelo poly(A).
E kiʻi i ka cDNA i ʻoki ʻia mai ke kahua hoʻomaka*2 ma ka poly(A)
Hoʻopili ʻia e hoʻopaʻa i ka hopena 3′
* Hoʻemi ʻia kēia hiki ke hoʻohana ʻia nā kumu mua oligo (dT). |
| kumu mua ʻole
| 6 a 9 mau kumu i ka lōʻihi, hiki ke hoʻopili i nā wahi he nui i ka wā transcription RNA | Hoʻohui i nā RNA a pau (tRNA, rRNA, a me mRNA)
He kūpono no nā transcripts me ka hoʻolālā lua koʻikoʻi, a i ʻole ke loaʻa nā mea hoʻomaka liʻiliʻi
Kiʻekiʻe cDNA Hua | Hoʻololi ʻia ka cDNA mai nā RNA āpau, ʻaʻole makemake ʻia a hiki ke hoʻoheheʻe i ka hōʻailona o ka mRNA i manaʻo ʻia.
e ʻoki ʻia ka cDNA |
| nā kumu mua kikoʻī | ʻO nā kumu mua maʻamau e kuhikuhi ana i nā kaʻina mRNA kikoʻī | waihona cDNA kiko'ī
Hoʻonui i ka naʻau
Ke hoʻohana nei i nā kumu mua qPCR | Hoʻopili wale ʻia i ka synthesis o hoʻokahi gene target |
Hoʻohuli transcriptase
ʻO Reverse transcriptase kahi enzyme e hoʻohana ana i ka RNA e synthesize DNA.Loaʻa i kekahi mau transcriptases hoʻohuli i ka hana RNase a hiki ke hoʻohaʻahaʻa i nā kaula RNA i nā kaula hybrid RNA-DNA ma hope o ke kākau ʻana.Inā ʻaʻohe hana enzymatic RNase, hiki ke hoʻohui ʻia ʻo RNaseH no ka pono qPCR kiʻekiʻe.ʻO nā enzyme maʻamau i hoʻohana ʻia me Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase a me avian myeloblastoma virus reverse transcriptase.No ka RT-qPCR, he mea maikaʻi ke koho i kahi transcriptase hoʻohuli me ka thermostability kiʻekiʻe, i hiki ke hana ʻia ka cDNA synthesis i nā mahana kiʻekiʻe, e hōʻoia ana i ka transcription kūleʻa o nā RNA me ka hoʻolālā kiʻekiʻe kiʻekiʻe, ʻoiai e mālama ana i kā lākou hana holoʻokoʻa a puni ka hopena, e hopena i nā hua cDNA kiʻekiʻe.
Nā huahana pili:
Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase
ʻO ka hana RNase H o ka reverse transcriptase
Hiki iā RNaseH ke hoʻohaʻahaʻa i nā kaula RNA mai nā duplexes RNA-DNA, e ʻae ana i ka synthesis maikaʻi o ka DNA stranded pālua.Eia nō naʻe, i ka wā e hoʻohana ai i ka mRNA lōʻihi ma ke ʻano he laʻana, hiki ke hoʻohaʻahaʻa ʻia ka RNA ma mua o ka manawa, e hopena i ka cDNA ʻoki ʻia.No laila, ʻoi aku ka maikaʻi o ka hōʻemi ʻana i ka hana RNaseH i ka wā cDNA cloning inā makemake ʻia ka synthesis o nā transcript lōʻihi.Ma ka hoʻokaʻawale ʻana, hoʻololi pinepine ʻia nā transcriptases me ka hana RNase H no nā noi qPCR no ka mea e hoʻonui lākou i ka hoʻoheheʻe ʻana o nā duplexes RNA-DNA i ka wā o ka pōʻai mua o PCR.
Hoʻolālā kumu
Pono e hoʻolālā ʻia nā kumu mua PCR i hoʻohana ʻia no ka ʻanuʻu qPCR ma RT-qPCR e hoʻopaʻa i kahi hui exon-exon, kahi e hiki ai i kahi mea hoʻonui hoʻonui ke kau i kahi palena exon-intron maoli.No ka mea, ʻaʻole i hoʻonui ʻia nā kaʻina DNA genomic i loko, ua hoʻemi kēia hoʻolālā i ka hopena o nā hopena maikaʻi ʻole i hoʻonui ʻia mai ka hoʻohaumia ʻana i ka DNA genomic.
Inā ʻaʻole hiki ke hoʻolālā ʻia nā primers e hoʻokaʻawale i nā palena exons a i ʻole exon-exon, pono paha e mālama i nā laʻana RNA me ka RNase-free DNase I a i ʻole dsDNase no ka wehe ʻana i ka DNA contamination.
Manao RT-qPCR
Pono e hoʻokomo ʻia kahi mana hoʻololi ʻino ʻole (-RT control) i nā hoʻokolohua RT-qPCR a pau e ʻike ai i ka haumia DNA (e like me ka genomic DNA a i ʻole nā huahana PCR mai nā hopena mua).Aia i loko o kēia mana nā ʻāpana hoʻololi a pau koe ka reverse transcriptase.No ka mea, ʻaʻole hiki ke hoʻololi i ka unuhi ʻana me kēia mana, inā ʻike ʻia ka PCR amplification, ʻoi aku ka nui o ka haumia mai DNA.
Ka manawa hoʻouna: ʻAukake-02-2022
