Hoʻohana ka ʻenehana hōʻoia molecular i nā ʻano biology molecular e ʻike i ka hōʻike a me ke ʻano o ka mea genetic o ke kino kanaka a me nā pathogens like ʻole, i hiki ai ke hoʻokō i ke kumu o ka wānana a me ka ʻike ʻana i nā maʻi.

I nā makahiki i hala iho nei, me ka hoʻonui ʻana a me ka hoʻonui ʻana o ka ʻenehana diagnostic molecular, ua lilo ka noiʻi lapaʻau o nā diagnostics molecular i mea nui a hohonu a hohonu, a ua komo ka mākeke diagnostics molecular i kahi manawa o ka ulu wikiwiki.

Hoʻopuka ka mea kākau i nā ʻenehana diagnostic molecular maʻamau ma ka mākeke, a ua māhele ʻia i ʻekolu ʻāpana: ʻo ka hapa mua e hoʻolauna i ka ʻenehana PCR, ʻo ka ʻāpana ʻelua e hoʻolauna i ka ʻenehana isothermal amplification nucleic acid, a ʻo ka ʻāpana ʻelua e hoʻolauna i ka ʻenehana sequencing.

01

Mahele I: ʻenehana PCR

ʻenehana PCR

ʻO PCR (polymerase chain reaction) kekahi o nā ʻenehana hoʻonui in vitro DNA, me ka mōʻaukala ʻoi aku ma mua o 30 mau makahiki.

Ua hoʻokumu ʻia ka ʻenehana PCR i ka makahiki 1983 e Kary Mullis o Cetus, USA.Ua noi ʻo Mullis no kahi patent PCR i ka makahiki 1985 a hoʻopuka i ka pepa haʻawina PCR mua ma Science i ka makahiki hoʻokahi.Ua lanakila ʻo Mullis i ka Nobel Prize in Chemistry i ka makahiki 1993.

Nā Kumu Kumu o ka PCR

Hiki i ka PCR ke hoʻonui i nā ʻāpana DNA i ʻoi aku ma mua o hoʻokahi miliona mau manawa.ʻO ke kumu ma lalo o ka catalysis o DNA polymerase, ua hoʻohana ʻia ka DNA strand makua ma ke ʻano he template, a ua hoʻohana ʻia kahi kumu mua ma ke ʻano he hoʻomaka no ka hoʻonui.Hoʻopili ʻia ia i loko o ka vitro ma o nā ʻanuʻu e like me ka denaturation, annealing, a me ka hoʻonui.ʻO ke kaʻina hana o ke kaula DNA i hoʻohui ʻia i ka DNA template strand makua.

Ua māhele ʻia ke kaʻina hana PCR maʻamau i ʻekolu mau ʻanuʻu:

1. Denaturation: E hoʻohana i ka wela kiʻekiʻe e hoʻokaʻawale i nā kaula pālua DNA.Ua haki nā paʻa hydrogen ma waena o nā kaula pālua DNA i nā wela kiʻekiʻe (93-98°C).

2. Annealing: Ma hope o ka hoʻokaʻawale ʻia ʻana o ka DNA stranded ʻelua, hoʻohaʻahaʻa ʻia ka mahana i hiki i ka primer ke hoʻopaʻa i ka DNA kaula hoʻokahi.

3. Hoʻonui: Hoʻomaka ka DNA polymerase e synthesize i nā kaula hoʻohui me nā kaula DNA mai nā kumu mua i hoʻopaʻa ʻia ke hoʻohaʻahaʻa ʻia ka mahana.Ke hoʻopau ʻia ka hoʻonui ʻana, hoʻopau ʻia kahi pōʻai, a pālua ka helu o nā ʻāpana DNA.

Hoʻopaʻa hou i kēia mau ʻanuʻu ʻekolu 25-35 mau manawa, e piʻi nui ka helu o nā ʻāpana DNA.

ʻO ka noʻonoʻo o ka PCR ʻo ia ka hiki ke hoʻolālā ʻia nā primers like ʻole no nā ʻano genes ʻokoʻa, i hiki ke hoʻonui ʻia nā ʻāpana gene i hoʻopaʻa ʻia i loko o kahi manawa pōkole.

I kēia manawa, hiki ke hoʻokaʻawale ʻia ka PCR i ʻekolu mau ʻāpana, ʻo ia hoʻi ka PCR maʻamau, fluorescent quantitative PCR a me digital PCR.

ʻO ka hanauna mua o PCR maʻamau

E hoʻohana i kahi mea hana hoʻonui PCR maʻamau e hoʻonui i ka gene i hoʻopaʻa ʻia, a laila e hoʻohana i ka electrophoresis gel agarose e ʻike ai i ka huahana, hiki ke hana i ka loiloi qualitative wale nō.

ʻO nā hemahema nui o ka PCR mua:

-Pono i ka hoʻonui ʻole kikoʻī a me nā hopena maikaʻi ʻole.

- He lōʻihi ka ʻike ʻana a paʻakikī ka hana.

- Hiki ke ho'āʻo qualitative wale nō.

ʻO ka lua-hanau fluorescence quantitative PCR

Hoʻohana ʻia ʻo Fluorescence quantitative PCR (Real-Time PCR), i ʻike ʻia ʻo qPCR, e nānā i ka hōʻiliʻili ʻana o nā huahana i hoʻonui ʻia ma o ka hōʻiliʻili ʻana o nā hōʻailona fluorescent ma ka hoʻohui ʻana i nā ʻōkuhi fluorescent e hiki ke hōʻike i ka holomua o ka ʻōnaehana pane, a e hoʻoponopono i nā hopena ma o ka fluorescence curve, a hiki ke helu ʻia me ke kōkua o ka waiwai Cq a me ka maʻamau.

Ma muli o ka hana ʻana o ka ʻenehana qPCR i kahi ʻōnaehana paʻa, ua hoʻemi ʻia ka probability o ka contamination, a hiki ke nānā ʻia ka hōʻailona fluorescence no ka ʻike quantitative, no laila ʻo ia ka mea i hoʻohana nui ʻia i ka hoʻomaʻamaʻa lāʻau lapaʻau a ua lilo i ʻenehana nui ma PCR.

Hiki ke hoʻokaʻawale ʻia nā mea fluorescent i hoʻohana ʻia i ka PCR quantitative fluorescent manawa maoli i: TaqMan fluorescent probes, molecular beacons and fluorescent dyes.

1) ʻO ka ʻimi ʻulaʻula TaqMan:

I ka hoʻonui ʻana o PCR, ua hoʻohui ʻia kahi ʻimi fluorescent kikoʻī i ka wā e hoʻohui ana i ʻelua mau primers.He oligonucleotide ka probe, a ua kapa inoa ʻia nā ʻaoʻao ʻelua me kahi pūʻulu fluorescent reporter a me kahi hui fluorescent quencher.

Ke paʻa ka ʻimi, ʻo ka hōʻailona fluorescent i hoʻokuʻu ʻia e ka hui mea hoʻolaha e hoʻopili ʻia e ka hui kinai;i ka wā o ka PCR amplification, ʻo ka hana exonuclease 5′-3′ o Taq enzyme e hoʻokaʻawale a hoʻohaʻahaʻa i ka ʻimi, e hana ana i ka pūʻulu fluorescent a me ka quencher Ua hoʻokaʻawale ʻia ka pūʻulu fluorescent, i hiki i ka ʻōnaehana nānā fluorescence ke loaʻa i ka hōʻailona fluorescence, ʻo ia hoʻi, i kēlā me kēia manawa e hoʻonui ʻia ka DNA strand me ka hoʻokumu ʻana o ka fluorescent me ka hoʻokumu ʻana o ka fluorescent. ka huahana PCR.

2) SYBR nā mea ʻulaʻula:

I loko o ka ʻōnaehana hopena PCR, ua hoʻohui ʻia ka nui o ka dye fluorescent SYBR.Ma hope o ka hoʻokomo ʻole ʻia ʻana o ka dye fluorescent SYBR i loko o ke kaula pālua DNA, hoʻopuka ia i kahi hōʻailona fluorescent.ʻO ka mole dye SYBR i hoʻokomoʻoleʻia i loko o ke kaulahao,ʻaʻole ia e hoʻokuʻu i kekahi hōʻailona fluorescent, ma laila e hōʻoiaʻiʻo ai i ka hōʻailona fluorescent ʻO ka hoʻonuiʻana i nā huahana PCR ua hui pūʻia me ka hoʻonuiʻana i nā huahana PCR.Hoʻopaʻa wale ʻo SYBR i ka DNA stranded ʻelua, no laila hiki ke hoʻohana ʻia ke kahe hoʻoheheʻe e hoʻoholo inā he kikoʻī ka hopena PCR.

3) Nā kukui molekala

ʻO ia kahi ʻōniʻoniʻo oligonucleotide i hoʻopaʻa inoa ʻia ma kahi o 8 mau kumu ma ka hopena 5 a me 3.Hoʻohui pū ʻia nā kaʻina waikawa nucleic ma nā ʻaoʻao ʻelua, e paʻa ai ka pūʻulu fluorescent a me ka hui kinai.Paʻa, ʻaʻole ia e hoʻopuka i ka fluorescence.

Ma hope o ka hana ʻia ʻana o ka huahana PCR, i ka wā o ke kaʻina hana annealing, ua hui pū ʻia ka ʻaoʻao waena o ka beacon molecular me kahi kaʻina DNA kikoʻī, a ua hoʻokaʻawale ʻia ka gene fluorescent mai ka gene quencher e hana i ka fluorescence.

ʻO nā hemahema nui o ka PCR lua-hanau:

Ke nele nei ka naʻau, a ʻaʻole pololei ka ʻike ʻana i nā mea hoʻohālike haʻahaʻa.

Loaʻa ka mana o ka waiwai hope, a hiki i ka hopena ke keakea.

PCR kikohoʻe ʻekolu

Heluhelu ʻia ka Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) i ka helu kope o ke kaʻina i hoʻopaʻa ʻia ma o ka ʻike ʻana i ka helu hope, a hiki ke hana i ka ʻike kikoʻī kikoʻī me ka hoʻohana ʻole ʻana i nā mana kūloko a me nā pihi maʻamau.

Hoʻohana ka PCR kikohoʻe i ka ʻike hope ʻana a ʻaʻole hilinaʻi i ka waiwai Ct (paepae pōʻai), no laila ʻoi aku ka liʻiliʻi o ka hopena PCR kikohoʻe e ka maikaʻi o ka hoʻonui ʻana, a ua hoʻomaikaʻi ʻia ka ʻae ʻana i nā mea hoʻopaneʻe PCR, me ka pololei kiʻekiʻe a me ka reproducibility.

Ma muli o nā hiʻohiʻona o ka naʻau kiʻekiʻe a me ka pololei kiʻekiʻe, ʻaʻole maʻalahi ia e ka PCR reaction inhibitors, a hiki iā ia ke hoʻokō i ka quantification ʻoiaʻiʻo me ka ʻole o nā huahana maʻamau, ua lilo ia i kahi noiʻi a me ka hotspot noi.

Wahi a nā ʻano like ʻole o ka ʻāpana pane, hiki ke hoʻokaʻawale ʻia i ʻekolu mau ʻano: microfluidic, chip a me nā ʻōnaehana droplet.