ʻO PCR manawa maoli, i ʻike ʻia ʻo quantitative PCR a i ʻole qPCR, he ala no ka nānā ʻana a me ka nānā ʻana i nā huahana PCR amplification.
Ma muli o ka maikaʻi o ka PCR quantitative i ka hana maʻalahi, wikiwiki a maʻalahi, ʻike kiʻekiʻe, hiki ke hoʻihoʻi maikaʻi, a me ka helu contamination haʻahaʻa, ua hoʻohana nui ʻia i ka hoʻāʻo ʻana i ka lāʻau lapaʻau, loiloi efficacy lāʻau, noiʻi hōʻike gene, noiʻi transgenic, ʻike gene, ʻike pathogen, ʻike holoholona a me nā mea kanu., ho'āʻo meaʻai a me nā māla ʻē aʻe.
No laila, inā ʻoe e hana nei i ka noiʻi kumu i ka ʻepekema ola, a i ʻole nā ​​​​limahana o nā hui lāʻau lapaʻau, nā ʻoihana mahiʻai holoholona, ​​​​nā hui meaʻai, a i ʻole nā ​​​​limahana o ka nānā ʻana-puka a me nā keʻena kuʻuna, nā keʻena kiaʻi kaiapuni, nā halemai a me nā ʻāpana ʻē aʻe, e ʻike ʻia ʻoe a i ʻole pono ʻoe e ʻike i ka ʻike o ka mastering quantitative PCR.

Kumu o ka PCR manawa maoli

ʻO ka PCR manawa maoli kahi ʻano e hoʻohui ʻia ai nā mea fluorescent i ka ʻōnaehana hopena PCR, a nānā ʻia ka ikaika o ka hōʻailona fluorescence i ke kaʻina o ka hopena PCR i ka manawa maoli e kahi mea PCR quantitative, a ma hope o ka ʻikepili hoʻokolohua e nānā ʻia a hoʻoponopono ʻia.

【ʻĀpana hoʻonui】ʻO ia ka pihi e wehewehe ana i ke kaʻina hana o ka PCR.ʻAʻole ʻo ka pihi hoʻonui o PCR he pihi exponential maʻamau, akā he pihi sigmoid.

[Platform phase of amplification curve]Me ka hoʻonui ʻana o ka helu o nā pōʻai PCR, ka inactivation o ka DNA polymerase, ka hoʻopau ʻana o nā dNTP a me nā primers, a me ka pale ʻana i ka hopena synthesis e ka hopena o ka pyrophosphate huahana, a me nā mea ʻē aʻe, ʻaʻole e hoʻonui pinepine ka PCR., a e komo i kahi pāpū.

[Mahele Hoʻonui Hoʻonui ʻia o ka Curve Hoʻonui]ʻOiai ʻokoʻa loa ka pae pāpū, ma kekahi ʻāpana o ka ʻāpana ulu exponential o ka pihi hoʻonui, maikaʻi loa ka hoʻihoʻi hou ʻana, he mea nui loa ia no ka loiloi quantitative o PCR.

[Waiwai paepae a me ka waiwai Ct]Hoʻonoho mākou i ka waiwai palena o ka ʻike fluorescence ma ke kūlana kūpono i ka wahi ulu exponential o ka pihi hoʻonui, ʻo ia hoʻi ka waiwai paepae (Threshold).ʻO ke kuʻina o ka waiwai paepae a me ka pihi hoʻonui ʻia ka waiwai Ct, ʻo ia hoʻi, ʻo ka waiwai Ct e pili ana i ka helu o nā pōʻai (Threshold Cycle) i ka wā i hiki ai ka waiwai paepae.

Hōʻike maopopo ka pakuhi ma lalo i ka pilina ma waena o ka laina paepae a me ka pihi hoʻonui, ka paepae a me ka waiwai Ct.

【Pehea e helu ai?】

Ua hōʻoiaʻiʻo ʻia e ka manaʻo makemakika ʻo ka waiwai Ct he pilina laina inverse me ka logarithm o ka helu o nā mamana mua.Mālama ʻo Real Time PCR i nā huahana hoʻonui PCR i ka manawa maoli a helu iā lākou i ka wā o ka hoʻonui ʻana.

No kēlā me kēia pōʻai o PCR, ua piʻi nui ka DNA i 2 mau manawa, a hiki koke i kahi pāpū.

Ke manaʻo nei ʻo ka nui o ka DNA hoʻomaka ʻo A₀ , ma hope o n pōʻaiapuni, hiki ke hōʻike ʻia ka nui o ka huaʻōlelo DNA penei:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

A laila, ʻoi aku ka nui o ka nui o ka DNA mua A 0, ʻoi aku ka wikiwiki o ka nui o ka huahana i hoʻonui ʻia i ka waiwai ʻike An , a ʻo ka helu o nā pōʻai i ka wā e hiki ai iā An ka waiwai Ct.ʻO ia hoʻi, ʻoi aku ka nui o ka helu DNA mua A 0, ʻoi aku ka nui o ka piʻi ʻana o ka pihi hoʻonui, a ʻoi aku ka liʻiliʻi o ka helu i makemake ʻia o nā pōʻai n.

Lawe mākou i ka dilution gradient o ka maʻamau o ka ʻike ʻike ʻia a hoʻohana iā ia ma ke ʻano he kumu hoʻohālike no Real Time PCR, a e loaʻa kahi ʻano o nā pihi hoʻonui i nā manawa like ma ke ʻano o ka hoʻomaka ʻana i ka nui o ka DNA mai ka nui a i ka liʻiliʻi.E like me ka pilina laina ma waena o ka waiwai Ct a me ka logarithm o ka helu o nā kumu hoʻomaka, aHiki ke hana 'ia ka [pahu ma'amau .

Ma ka hoʻololi ʻana i ka waiwai Ct o ka hāpana me ka ʻike ʻole ʻia i loko o ka pihi maʻamau, hiki ke loaʻa ka nui template mua o ka hāpana me ka ʻike ʻike ʻole ʻia, ʻo ia ke kumu nui o Real Time PCR.

ʻO ke ala ʻike o ka PCR manawa maoli

ʻIke ʻo PCR manawa maoli i nā huahana hoʻonui PCR ma ka ʻike ʻana i ka ikaika o ka fluorescence i ka ʻōnaehana pane.

Ke Kumu o ke Kaʻina Hoʻokomo ʻana i ka Pelo Fluorescent】

ʻO nā mea ʻulaʻula, e like me TB Green ® , hiki ke hoʻopaʻa pono ʻole i ka DNA stranded pālua i nā ʻōnaehana PCR a fluoresce ma ka hoʻopaʻa ʻana.

Ua hoʻonui nui ʻia ka ikaika o ka fluorescence i ka ʻōnaehana pane me ka piʻi ʻana o nā pōʻai PCR.Ma ka ʻike ʻana i ka ikaika o ka fluorescence, hiki ke nānā ʻia ka nui o ka hoʻonui ʻana o DNA i ka ʻōnaehana pane i ka manawa maoli, a laila hiki ke hoʻohālikelike ʻia ka nui o ke kumu hoʻomaka i ka hāpana.

【Ke kumu o ke ʻano hana ʻimi fluorescent】

ʻimi ʻulaʻulahe kaʻina waika nucleic me ka pūʻulu fluorescent ma ka hopena 5′ a me ka pūʻulu kinai ma ka hopena 3′, hiki iā ia ke hoʻopaʻa pono i ke kumu hoʻohālike.Ke paʻa ka probe, hoʻopiʻi ʻia ka fluorescence i hoʻopuka ʻia e ka fluorophore e ka hui quenching a ʻaʻole hiki ke fluoresce.Ke hoʻoheheʻe ʻia ka probe, e hoʻokaʻawale ka mea fluorescent a hoʻopuka i ka fluorescence.

Hoʻohui ʻia kahi ʻimi fluorescent i ka hopena hopena PCR.I ka wā o ke kaʻina hana annealing, e hoʻopaʻa ʻia ka ʻimi fluorescent i ke kūlana kikoʻī o ka template.I ka wā o ka hoʻolōʻihi ʻana, hiki i ka hana exonuclease 5′→3′ o ka PCR enzyme ke hoʻoheheʻe i ka probe fluorescent hybridized me ka template, a ua hoʻokaʻawale ʻia ka mea fluorescent e hoʻopuka i ka fluorescence.Ma ka ʻike ʻana i ka ikaika o ka fluorescence o ka probe i ka ʻōnaehana pane, hiki ke hoʻokō ʻia ke kumu o ka nānā ʻana i ka nui o ka amplification o ka huahana PCR.

【Ke koho ʻana i ke ʻano ʻike Fluorescence】

Inā hoʻohana ʻia ia e hoʻokaʻawale i nā kaʻina me ka homology kiʻekiʻe a hana i ka ʻike PCR multiplex e like me ka SNP typing analysis, ʻaʻole hiki ke hoʻololi ʻia ke ʻano o ka fluorescent probe.
No nā hoʻokolohua PCR ʻOiaʻiʻo, hiki ke hoʻohana ʻia ke ʻano chimera fluorescent fluorescent maʻalahi, maʻalahi a haʻahaʻa.

probesStrong specificity, hiki i ka PCR multiplex

Ka hemahema

Nā koi kikoʻī kiʻekiʻe no ka amplification;

ʻAʻole hiki ke hana ʻia ka PCR multiplex Pono e hoʻolālā i nā ʻimi kikoʻī, ke kumu kūʻai kiʻekiʻe;

i kekahi manawa paʻakikī ka hoʻolālā probe

Nā huahana pili: