• ʻO ka PCR kahi hana i hoʻohana ʻia e hoʻonui i ka DNA mai kahi liʻiliʻi o ka maʻi DNA.Hoʻohana ʻo RT-PCR i ka transcription hoʻohuli e hana i kahi hoʻohālike DNA mai kahi kumu RNA a laila hiki ke hoʻonui ʻia.
• ʻO ka PCR a me RT-PCR ka hopena hope loa, aʻo qPCR a me RT-qPCR e hoʻohana i nā kinetics o ka helu o ka synthesis huahana i ka wā o ka pane PCR e helu i ka nui o ka template i loaʻa.
• ʻO nā ʻano hana hou, e like me ka PCR kikohoʻe, hāʻawi i ka helu piha o ke kumu hoʻohālike DNA mua, ʻoiai nā ʻano hana e like me isothermal PCR e hōʻemi i ka pono o nā lako makamae e hāʻawi i nā hopena hilinaʻi.

ʻO ka hopena kaulahao Polymerase (PCR) he mea maʻalahi a hoʻohana nui ʻia ke ʻano biology molecular e hoʻonui a ʻike i nā kaʻina DNA a me RNA.Ke hoʻohālikelike ʻia i nā ʻano kuʻuna o ka DNA cloning a me ka hoʻonui ʻana, hiki ke lawe pinepine i nā lā, pono ka PCR i mau hola wale nō.He koʻikoʻi koʻikoʻi ka PCR a koi i ka laʻana liʻiliʻi no ka ʻike a me ka hoʻonui ʻana i nā kaʻina kikoʻī.Ua holomua hou nā ʻano hana PCR maʻalahi mai ka DNA maʻalahi a me ka ʻike RNA.Ma lalo nei, ua hāʻawi mākou i kahi ʻike o nā ʻano PCR like ʻole a me nā reagents a mākou e hāʻawi ai ma Enzo Life Sciences no kāu mau noiʻi noiʻi.Manaʻo mākou e kōkua i nā ʻepekema e komo koke i nā PCR reagents e hoʻohana ai i kā lākou papahana noiʻi e hiki mai ana!

PCR

No ka PCR maʻamau, ʻo kahi DNA polymerase, magnesium, nucleotides, primers, ka DNA template e hoʻonui ʻia, a me kahi thermocycler.He mea maʻalahi ka hana PCR e like me kona kumu: 1) ua hoʻopaʻa ʻia ka DNA stranded ʻelua (dsDNA) i ka wela, 2) ua hoʻopili nā primers i nā kaula DNA hoʻokahi, a 3) ua hoʻolōʻihi ʻia nā primers e ka DNA polymerase, ka hopena i ʻelua kope o ka ke kaula DNA kumu.ʻO ke kaʻina denaturation, annealing, a me ka hoʻolōʻihi ʻana ma luna o ke ʻano o nā mahana a me nā manawa i ʻike ʻia he hoʻokahi pōʻai o ka amplification (Fig. 1).

Pono e hoʻopololei ʻia kēlā me kēia ʻanuʻu o ka pōʻai no ke kumu hoʻohālike a me ka hoʻonohonoho mua i hoʻohana ʻia.Hoʻopau hou ʻia kēia pōʻai ma kahi o 20-40 mau manawa, a laila hiki ke nānā ʻia ka huahana i hoʻonui ʻia, ma ke ʻano maʻamau e ka gel agarose (Fig. 2).

No ka mea he ʻano koʻikoʻi koʻikoʻi ka PCR a koi ʻia nā puke liʻiliʻi loa no nā hopena hoʻokahi, ʻoi aku ka hoʻomākaukau ʻana i kahi master mix no kekahi mau hopena.Pono e hui maikaʻi ʻia ka mix master a laila e hoʻokaʻawale ʻia e ka helu o nā hopena, e hōʻoia ana e loaʻa i kēlā me kēia pane ka nui like o ka enzyme, dNTPs, a me nā primers.Nui nā mea hoʻolako, e like me Enzo Life Sciences, hāʻawi pū i nā hui PCR i loaʻa i nā mea āpau koe wale nō nā primers a me ka hoʻohālike DNA.

Hōʻike nā ʻāina ʻo Guanine/Cytosine-rich (GC-rich) i kahi paʻakikī i nā ʻenehana PCR maʻamau.ʻOi aku ka paʻa o nā kaʻina waiwai GC ma mua o nā kaʻina me ka maʻiʻo GC haʻahaʻa.Eia kekahi, ʻo nā kaʻina waiwai GC e hana i nā hale lua, e like me nā puka lou.ʻO ka hopena, paʻakikī ka hoʻokaʻawale ʻana o nā kaula pālua waiwai GC i ka wā denaturation.No laila, ʻaʻole hiki i ka DNA polymerase ke synthesize i ke kaula hou me ka ʻole o ke keakea.Hiki ke hoʻomaikaʻi i kēia ma kahi mahana denaturation kiʻekiʻe, a ʻo ka hoʻololi ʻana i kahi mahana annealing kiʻekiʻe a me ka manawa annealing pōkole hiki ke pale i ka hoʻopaʻa ʻole ʻana o nā primers waiwai nui o GC.Hiki i nā reagents hou ke hoʻonui i ka hoʻonui ʻana i nā kaʻina waiwai GC.ʻO DMSO, glycerol, a me betaine ke kōkua i ka hoʻopau ʻana i nā hale lua i hoʻokumu ʻia e nā pilina GC a ma laila e hoʻomaʻamaʻa i ka hoʻokaʻawale ʻana o nā kaula pālua.

Hoomaka wela PCR

ʻO ka hoʻonui ʻole ʻia kahi pilikia e hiki mai ana i ka wā PCR.ʻO ka hapa nui o nā polymerases DNA i hoʻohana ʻia no ka PCR e hana maikaʻi loa ma kahi o 68°C a 72°C.Hiki nō naʻe ke ʻeleu ka enzyme ma nā mahana haʻahaʻa, ʻoiai i kahi degere haʻahaʻa.Ma nā mahana ma lalo o ka mahana annealing, hiki i nā primers ke hoʻopaʻa pono ʻole a alakaʻi i ka hoʻonui ʻole ʻana, ʻoiai ke hoʻonohonoho ʻia ka hopena ma ka hau.Hiki ke pale ʻia kēia ma ka hoʻohana ʻana i ka polymerase inhibitors e hoʻokaʻawale mai ka DNA polymerase i ka manawa wale nō i hiki ai i kahi mahana, no laila ka huaʻōlelo hot start PCR.Hiki i ka mea hoʻopaneʻe ke lilo i antibody nāna e hoʻopaʻa i ka polymerase a me nā dentures i ka mahana denaturation mua (95°C maʻamau).

Polymerase Pono Kiʻekiʻe

ʻOiai ke hoʻonui pololei nei nā polymerases DNA i ke kaʻina hoʻohālikelike kumu, hiki ke hana hewa i ka hoʻohālikelike nucleotide.Hiki ke hoʻohālikelike ʻia i nā noi e like me ka cloning i nā transcripts i ʻoki ʻia, a me ka unuhi hewa ʻole a i ʻole nā ​​​​protein hana ʻole i lalo.No ka pale ʻana i kēia mau mismatches, ua ʻike ʻia nā polymerases me kahi hana "proofreading" a hoʻokomo ʻia i loko o ke kaʻina hana.Ua ʻike ʻia ka polymerase hōʻoia mua, Pfu, ma 1991 ma Pyrococcus furiosus.He 3' a 5' hana exonuclease kēia Pfu enzyme.Ke hoʻonui ʻia ka DNA, hoʻoneʻe ka exonuclease i nā nucleotides like ʻole ma ka hope 3' o ke kaula.Hoʻololi ʻia ka nucleotide kūpono, a hoʻomau ka DNA synthesis.ʻO ka ʻike ʻana i nā kaʻina nucleotide hewa e pili ana i ka pilina paʻa no ka nucleoside triphosphate pololei me ka enzyme, kahi e hoʻopaʻa pono ʻole ai ka hoʻopaʻa ʻana i ka synthesis a hiki ke hoʻololi pololei.ʻO ka hana hōʻoia ʻana o ka Pfu polymerase ka hopena i nā hewa liʻiliʻi ma ka kaʻina hope i hoʻohālikelike ʻia me Taq DNA polymerase.I kēia mau makahiki i hala iho nei, ua ʻike ʻia nā enzymes proofreading ʻē aʻe, a ua hana ʻia nā hoʻololi o ka enzyme Pfu kumu i mea e hōʻemi hou ai i ka helu hewa i ka wā o ka hoʻonui ʻana o DNA.

RT-PCR

ʻAe ʻia ka hoʻohana ʻana i ka RNA ma ke ʻano he hoʻohālike.Hiki i kahi hana hou ke ʻike a hoʻonui i ka RNA.Hoʻololi ʻia ka RNA i loko o ka DNA hoʻohui (cDNA), me ka hoʻohana ʻana i ka transcriptase.Pono ka maikaʻi a me ka maʻemaʻe o ka template RNA no ka holomua o RT-PCR.ʻO ka hana mua o ka RT-PCR ka synthesis o kahi hybrid DNA/RNA.Loaʻa iā Reverse transcriptase kahi hana RNase H, e hoʻohaʻahaʻa i ka ʻāpana RNA o ka hybrid.A laila hoʻopau ʻia ka mole mole DNA i hoʻopaʻa ʻia e ka DNA polymerase hana o ka reverse transcriptase i cDNA.Hiki ke hoʻololi i ke kaʻina hana amplification ka maikaʻi o ka hopena mua.Mai kēia manawa, hoʻohana ʻia ke kaʻina hana PCR maʻamau e hoʻonui i ka cDNA.ʻO ka hiki ke hoʻihoʻi i ka RNA i cDNA e RT-PCR he nui nā pono, a ua hoʻohana mua ʻia ia no ka nānā ʻana i nā huaʻōlelo gene.ʻO ka RNA he kaula hoʻokahi a paʻa ʻole, he mea paʻakikī ke hana pū me.Hoʻohana maʻamau ia ma ke ʻano he hana mua ma qPCR, ka mea e helu ana i nā transcripts RNA i kahi laʻana olaola.

qPCR a me RT-qPCR

Hoʻohana ʻia ka Quantitative PCR (qPCR) e ʻike, ʻike a helu i nā ʻakika nucleic no nā noi he nui.Ma RT-qPCR, helu pinepine ʻia nā RNA transcript ma ka hoʻohuli ʻana iā lākou i loko o ka cDNA ma mua, e like me ka mea i wehewehe ʻia ma luna, a laila hoʻokō ʻia ka qPCR.E like me ka PCR maʻamau, hoʻonui ʻia ka DNA e ʻekolu mau ʻanuʻu: denaturation, annealing, a elongation.Eia nō naʻe, ma qPCR, hiki i ka hōʻailona fluorescent ke hōʻiliʻili i ka ʻikepili i ka holomua ʻana o PCR.He nui nā pōmaikaʻi o kēia ʻenehana ma muli o ke ʻano o nā ʻano a me nā kemika i loaʻa.

I loko o ka qPCR i hoʻopaʻa ʻia i ka wai (maʻamau ʻōmaʻomaʻo), ʻae ka lepili fluorescent i ka helu ʻana o nā molekole DNA i hoʻonui ʻia ma o ka hoʻohana ʻana i kahi wai hoʻopaʻa paʻa dsDNA.I loko o kēlā me kēia pōʻai, ana ʻia ka fluorescence.Hoʻonui like ka hōʻailona fluorescence i ka nui o ka DNA replicated.No laila, ua helu ʻia ka DNA i ka "manawa maoli" (Fig. 3).ʻO nā pōʻino o ka qPCR i hoʻopaʻa ʻia i ka waiʻona, ʻo ia hoʻokahi wale nō pahuhopu e hiki ke nānā ʻia i ka manawa a e hoʻopaʻa ʻia ke kala i kekahi ds-DNA i loko o ka hāpana.

Ma ka qPCR ma muli o ka ʻimi noiʻi, hiki ke ʻike ʻia nā pahuhopu he nui i ka manawa like i kēlā me kēia laʻana, akā pono kēia i ka hoʻolālā a me ka hoʻolālā ʻana i kahi (nā) kikoʻī kikoʻī i hoʻohana ʻia me nā primers.Loaʻa nā ʻano hoʻolālā probe, akā ʻo ka ʻano maʻamau he hydrolysis probe, kahi e hoʻokomo ai i ka fluorophore a me ka quencher.ʻO ka hoʻololi ʻana o ka ikehu hoʻoula hou (FRET) e pale i ka hoʻokuʻu ʻana o ka fluorophore ma o ka quencher i ka wā e paʻa ana ka ʻimi.Eia nō naʻe, i ka hopena o ka PCR, ua hydrolyzed ka probe i ka wā o ka hoʻonui mua ʻana a me ka hoʻonui ʻana i ke kaʻina kikoʻī i hoʻopaʻa ʻia.Hoʻokaʻawale ka ʻoki ʻana o ka probe i ka fluorophore mai ka quencher a hopena i ka hoʻonui ʻana i ka hoʻonui ʻana i ka fluorescence (Fig. 4).No laila, ʻo ka hōʻailona fluorescence mai kahi pane qPCR i hoʻopaʻa ʻia i ka probe e like me ka nui o ke kaʻina pahuhopu probe i loaʻa i ka hāpana.No ka mea, ʻoi aku ka kikoʻī o ka qPCR i hoʻopaʻa ʻia ma mua o ka qPCR i hoʻopaʻa ʻia i ka wai, ʻo ia ka ʻenehana i hoʻohana ʻia i nā hoʻokolohua diagnostics-based qPCR.

Hoʻonui Isothermal

Pono ka PCR i ʻōlelo ʻia ma luna nei i nā lako thermocycling pipiʻi e hoʻonui pono i ka wela o ke keʻena no ka denaturation, annealing, a me nā ʻanuʻu hoʻonui.Ua hoʻomohala ʻia kekahi mau ʻano hana ʻaʻole pono ia mau mea kikoʻī a hiki ke hana ʻia i loko o kahi ʻauʻau wai maʻalahi a i ʻole i loko o nā keʻena hoihoi.Kapa ʻia kēia mau ʻenehana i ka isothermal amplification a me ka hana e pili ana i ka exponential, linear, a i ʻole cascade amplification.

ʻO ke ʻano hoʻonui isothermal kaulana loa ʻo ia ka loop-mediated isothermal amplification, a i ʻole LAMP.Hoʻohana ʻo LAMP i ka hoʻonui exponential ma 65⁰C e hoʻonui i ka DNA template a i ʻole RNA.I ka hana ʻana i ka LAMP, hoʻohana ʻia nā ʻehā a ʻeono i hoʻohui ʻia i nā ʻāpana o ka DNA i hoʻopaʻa ʻia me ka polymerase DNA e synthesize i ka DNA hou.Loaʻa i ʻelua o kēia mau kumu mua nā kaʻina hoʻomaikaʻi e ʻike i nā kaʻina o nā primers ʻē aʻe a hoʻopaʻa iā lākou, e ʻae ai i kahi ʻano "loop" e hana i loko o ka DNA synthesized hou a laila kōkua i ka annealing primer i nā pōʻai hope o ka amplification.Hiki ke ʻike ʻia ka LAMP e nā ʻano like ʻole, me ka fluorescence, agarose gel electrophoresis, a i ʻole colorimetry.ʻO ka maʻalahi o ka nānā ʻana a me ka ʻike ʻana i ka hele ʻana a i ʻole ka loaʻa ʻole o ka huahana e ka colorimetry a me ka nele o nā lako makamae i koi ʻia ua lilo ʻo LAMP i koho kūpono no ka hoʻāʻo ʻana iā SARS-CoV-2 ma nā wahi i loaʻa ʻole ai ka hoʻāʻo ʻana o ka lāʻau lapaʻau. ʻAʻole i hiki, a i ʻole i loko o nā keʻena i loaʻa ʻole i nā lako thermocycling PCR ma mua.