Ma nā hoʻokolohua qPCR, he loulou koʻikoʻi ka hoʻolālā kumu.Ua pili pono paha nā primers a i ʻole e pili ana i ka hiki ʻana o ka pono amplification i ka maʻamau, inā he kikoʻī nā huahana i hoʻonui ʻia, a inā loaʻa nā hopena hoʻokolohua.
No laila pehea e hoʻomaikaʻi ai i ka kikoʻī kumu qPCR?High amplification pono?
I kēia lā, e lawe mākou iā ʻoe e hoʻolālā i nā kumu mua qPCR, a e ʻae i ka hoʻolālā kumu qPCR e lilo i mākaukau lore kūpono i nā hoʻokolohua.
I ka hoʻolālā ʻana i nā kumu mua qPCR, e hoʻolohe maʻamau i kēia mau ʻōlelo: pono e hoʻolālā ʻia nā primers ma waena o nā introns e like me ka hiki, ʻo ka lōʻihi o ka huahana he 100-300 bp, ʻo ka waiwai Tm e kokoke loa i 60 ° C, a ʻo nā kumu mua a me lalo e pili kokoke i ka hiki, a ʻo ka hopena o ka primer he G a i ʻole C, etc.
1. Hoʻolālā o nā primers e pili ana i nā introns
I ka hoʻolālā ʻana i nā kumu mua qPCR, ke koho ʻana i nā primers i hoʻolālā ʻia ma waena o nā introns hiki ke pale i ka hoʻohālikelike gDNA mai ka hoʻonui ʻia ʻana, a loaʻa nā huahana a pau mai ka hoʻonui ʻana o cDNA, no laila e hoʻopau i ka mana o ka contamination gDNA.
2. Ka lōʻihi mua
ʻO ka lōʻihi mua ma waena o 18-30 nt, a ʻo ka lōʻihi o ka huahana amplification pono e hoʻomalu ʻia ma waena o 100-300 bp e like me ka hiki.
Inā pōkole loa ka primer, e alakaʻi ia i ka hoʻonui ʻole kikoʻī, a inā lōʻihi loa, e hana maʻalahi ia i ke ʻano lua (e like me ka hoʻolālā lauoho).Inā lōʻihi loa ka huahana amplification, ʻaʻole kūpono ia no ka hopena o ka polymerase, e hoʻopilikia i ka pono o ka PCR amplification.
3. GC maʻiʻo a me ka waiwai Tm
Pono e mālama ʻia ka ʻike GC o nā primers ma waena o 40% a me 60%.Inā kiʻekiʻe a haʻahaʻa paha, ʻaʻole kūpono ia e hoʻomaka i ka hopena.ʻO ka maʻiʻo GC o nā kumu mua a me ka huli ʻana e pili kokoke i ka like i mea e loaʻa ai ka waiwai Tm like a me ka wela hoʻopulapula.
Pono ka waiwai Tm ma waena o 55-65°C i ka hiki loa, ma kahi o 60°C, a o ka waiwai Tm o ke kahawai i uka a me lalo e pili kokoke loa, aole oi aku mamua o 4°C.
4. E hōʻalo i ke koho ʻana iā A ma ka hopena 3′ o ke kumu mua
Ke hoʻohālikelike ʻia ka hopena 3′ o ke kumu mua, nui nā ʻokoʻa i ka hana synthesis o nā kumu like ʻole.Inā ʻo A ke kumu hope loa, hiki iā ia ke hoʻomaka i ka synthesis kaulahao i ka hihia o ka like ʻole, a inā ʻo ke kumu hope ʻo T I ka wā , ua hoʻemi nui ʻia ka maikaʻi o ka induction mismatch.No laila, e ho'āʻo e hōʻole i ke koho ʻana iā A ma ka hopena 3′ o ke kumu mua, a ʻoi aku ka maikaʻi o ke koho ʻana iā T.
Inā he kumu hoʻonanea, ʻaʻole hiki iā G ka hopena 5′ o ka ʻimi noiʻi, no ka mea, ʻoiai ke hoʻopili ʻia kahi kumu G hoʻokahi i ka pūʻulu mea hōʻike fluorescent FAM, hiki nō iā G ke kinai i ka hōʻailona fluorescent i hoʻopuka ʻia e ka pūʻulu FAM, e hopena i nā hopena maikaʻi ʻole.Hōʻike.
5. Māhele kumu
ʻO ka māhele ʻana o nā kumu ʻehā ma ka papa mua he mea maʻamau, e pale ana i ka ʻoi aku ma mua o 3 mau G a i ʻole C ma ka hopena 3′, a ʻoi aku ma mua o 3 mau hope.He mea maʻalahi iā G a i ʻole C ke hoʻohua i ka paʻa ʻana ma ka māhele ʻāpana waiwai GC.
6. Pono ka ʻāina hoʻolālā mua e pale i nā hale hana lua paʻakikī.
ʻO ka hana lua i hoʻokumu ʻia e ke kaula hoʻokahi o ka huahana amplification e hoʻopilikia i ka holomua o ka PCR.Ma ka wānana ʻana inā he ʻano hana lua ma ke kaʻina pahuhopu ma mua, e hoʻāʻo e pale i kēia māhele i ka hoʻolālā ʻana o nā primers.
7. Pono nā primers pono'ī a ma waena o nā kumu mua e pale i nā kumu hoʻohui.
ʻAʻole hiki ke hoʻohui pū ʻia 4 kumu ma waena o ka primer ponoʻī a me ka primer.ʻAʻole pono ke kaʻina hoʻohui o ka primer ponoʻī, i ʻole e pelu ia iā ia iho e hana i kahi ʻano lauoho lauoho, e pili ana i ka hui annealing o ka primer a me ka template.
ʻAʻole hiki ke loaʻa nā kaʻina hoʻohui ma waena o nā kumu mua a me lalo.ʻO ka hoʻohui ʻana ma waena o nā primers e hana i nā dimer primer, kahi e hōʻemi ai i ka pono PCR a pili pū i ka pololei quantitative.Inā ʻaʻole hiki ke ʻalo ʻia ke ʻano kumu-dimer a me ka lauoho lauoho, ʻaʻole kiʻekiʻe loa ka waiwai △G (e emi iho ma mua o 4.5 kcal/mol).
8. Hoʻonui nā primers i ka huahana kikoʻī.
ʻO ka pahuhopu hope loa o ka ʻike qPCR ʻo ia ka hoʻomaopopo ʻana i ka nui o ka gene target.Inā loaʻa ka hoʻonui ʻole kikoʻī, ʻaʻole pololei ka helu.No laila, ma hope o ka hoʻolālā ʻia ʻana o nā primers, pono lākou e hoʻāʻo ʻia e BLAST, a hoʻohālikelike ʻia ka kikoʻī o nā huahana i ka waihona sequence.
A laila, lawe mākou i ke kanaka GAS6 (Growth arrest specific 6) gene i laʻana no ka hoʻolālā ʻana i nā kumu mua qPCR.
01 ninau gene
Homo GAS6ma o NCBI .Maʻaneʻi, pono mākou e noʻonoʻo i ka hoʻohālikelike ʻana i ka inoa gene a me nā ʻano ʻano i mea e paʻa ai lākou.
02 E huli i ke kaʻina gene
(1) Inā he DNA genomic ke kaʻina pahuhopu, koho i ka mea mua, ʻo ia ke kaʻina DNA genomic o ka gene.
(2) Inā ʻo ka mRNA ke kaʻina pahuhopu, koho i ka lua.Ma hope o ke komo ʻana, kaomi iā "CDS" ma ka papa ma lalo.ʻO ka ʻaoʻao ʻulaʻula ʻulaʻula ke kaʻina coding o ka gene.
03 Nā kumu hoʻolālā
E hoʻokomo i ke kikowaena Primer-BLAST
E hoʻokomo i ka helu gene sequence a i ʻole ke kaʻina i ka format Fasta ma ka ʻaoʻao hema o luna, a hoʻopiha i nā ʻāpana kūpono.

Kaomi "E kiʻi i nā primers" a e puka mai ʻo NCBI e haʻi iā ʻoe e hoʻonui ʻia kēlā koho koho i nā ʻano like ʻole.Hiki iā mākou ke nānā i nā ʻano like ʻole splicing a hoʻouna iā lākou no ka loaʻa ʻana o ka pālua kumu kūpono (e like me ka hōʻike ʻana ma ke kiʻi ma lalo).He ʻumi kekona paha kēia kaʻina hana.
ʻO ka mahana hoʻoheheʻe o kēia mau hui mua ma kahi o 60°C.Wahi a ke kumu o ka hoʻokolohua, koho i nā primers me ka lōʻihi maʻalahi, ka kikoʻī maikaʻi a me ka hoʻokō pono ʻole o nā primers no ka hoʻokolohua, a ʻoi aku ka kiʻekiʻe o ka holomua!
04Ka hōʻoia kikoʻī kumu mua
ʻO kaʻoiaʻiʻo, ma kahi o ka hoʻolālā ʻana i nā primers, hiki i ka Primer-Blast ke loiloi i nā primers a mākou i hoʻolālā ai iā mākou iho.E hoʻi i ka ʻaoʻao hoʻolālā kumu, e hoʻokomo i nā kumu mua a me lalo a mākou i hoʻolālā ai, a ʻaʻole e hoʻoponopono ʻia nā ʻāpana ʻē aʻe.Ma hope o ka hoʻouna ʻana, hiki iā ʻoe ke ʻike inā loaʻa nā kumu mua ma nā ʻano genes ʻē aʻe.Inā hōʻike ʻia lākou a pau ma ka gene a mākou e makemake ai e hoʻonui , e hōʻike ana he maikaʻi ke kikoʻī o kēia mau kumu mua!(No ka laʻana, ʻo kēia wale nō ka hopena o ka nīnau mua!)

05 ʻO ka manaʻo maikaʻi loa
He aha ke ʻano o ka primer "kūpono" i hoʻohui ʻia i ka "hoʻoikaika hoʻonui a hiki i ke kūlana", "nā ʻano huahana hoʻonui", a me nā "hopena hoʻokolohua hilinaʻi"?
Ka hoʻonui ʻana i ka pono

kahe hoohehee
ʻO ka hoʻonuiʻana i ka pono o nā primers hiki i ka 90% -110%,ʻo ia hoʻi ka maikaʻi o ka hoʻonuiʻana i ka maikaʻi, aʻo ka'ōni hoʻoheheʻe he hoʻokahi peak a maʻamau Tm> 80 ° C,ʻo ia hoʻi he maikaʻi ke kiko'ī hoʻonui.
 
Nā huahana pili:
Maʻalahi PCR manawa maoli–SYBR GREEN I
ʻO ka manawa maoli PCR Easy-Taqman