ʻO ka PCR ka ʻenehana hoʻonui nui o ka nucleic acid a hoʻohana nui ʻia ma muli o kona naʻau a me kāna kikoʻī.Eia nō naʻe, koi ʻo PCR i ka denaturation thermal hou a ʻaʻole hiki ke hoʻopau i nā palena o ka hilinaʻi ʻana i nā mea hana a me nā mea hana, e kaupalena ana i kāna noi ʻana i ka hoʻāʻo ʻana i nā kahua lapaʻau.

Mai ka hoʻomaka ʻana o nā makahiki 1990, ua hoʻomaka ka nui o nā laboratories e hoʻomohala i ka ʻenehana hoʻonui ʻana i ka mahana e pono ʻole ai ka denaturation thermal.I kēia manawa ua hoʻomohala lākou i ka ʻenehana hoʻonui isothermal i hoʻopili ʻia i ka loop-mediated, strand replacement isothermal amplification technology, rolling circle isothermal amplification technology, a me ka nucleic acid sequence dependence.ʻenehana hoʻonui isothermal a me nā ʻenehana ʻē aʻe. 

Loop-mediated isothermal amplification

Hoʻokumu ʻia ka manaʻo hoʻonui ma ka ʻoiaʻiʻo aia ʻo DNA i kahi kūlana equilibrium ikaika ma kahi o 65°C.Ke hoʻopaʻa ʻia kekahi kumu mua a hoʻonui ʻia i ka ʻāpana hoʻohui o ke kaula kaulua, e hoʻokaʻawale ke kaula ʻē aʻe a lilo i kaula hoʻokahi.

Ma kēia mahana, hoʻohana ʻo DNA i 4 mau mea kikoʻī kikoʻī e hilinaʻi i kahi strand-displacement DNA polymerase e hana i ka synthesis o ka strand-displacement DNA ponoʻī e holo mau.

E hoʻoholo mua i nā ʻāpana kikoʻī 6 F3, F2, F1, B1, B2, B3 ma ka gene i hoʻopaʻa ʻia, a laila e hoʻolālā i nā ʻāpana 4 ma muli o kēia mau ʻāpana kikoʻī 6 (e like me ka hōʻike ʻana ma ke kiʻi ma lalo nei):

ʻO ka mua o loko (FIP) i haku ʻia me F1c a me F2.

Hoʻokumu ʻia ka backward inner primer (BIP) me B1c a me B2, a hoʻohana ʻia ʻo TTTT ma ke ʻano he spacer ma waena.

ʻO nā kumu mua o waho F3 a me B3 i haku ʻia me nā ʻāpana F3 a me B3 ma ka gene i manaʻo ʻia.

I loko o ka ʻōnaehana hoʻololi LAMP, ʻoi aku ka nui o ka neʻe ʻana o ka primer i loko i nā manawa he nui o ka primer waho.Hoʻohui mua ʻia ka mea mua o loko me ke kaula hoʻohālike e hoʻohui i kahi kaula hoʻohui e hana i kahi kaula pālua DNA.A laila, hoʻohui ʻia ka mea mua o waho me ke kaula template e hana i kahi kaula pālua DNA.Ma lalo o ka hana a BstDNA polymerase, hoʻokuʻu ʻia ke kaula hoʻohui i hoʻohui ʻia e ka primer i loko.Ma hope o ke ʻano o nā hopena, ua hoʻokumu ʻia ke kaula hoʻohui i hoʻokahi kaula DNA me kahi ʻano dumbbell.

Hoʻohana ʻia ka dumbbell structure DNA one strand ponoʻī ma ke ʻano he laʻana e hoʻomau i ka hana ʻana i ka DNA hoʻololi stem-loop structure DNA me ka hopena hāmama.Ke alakaʻi nei nā mea mua o loko a me waho i ka DNA hoʻololi stem-loop structure e hoʻomau mau i ka neʻe ʻana o ke kaula a me ka hoʻonui ʻana i nā hopena, a i ka hopena e hana i nā hale pūlima me nā lōʻihi like ʻole.Huina DNA.

ʻO nā pono a me nā pōʻino o ka hoʻonui isothermal loop-mediated

Nā pōmaikaʻi o LAMP:

(1) ʻO ka hana hoʻonui kiʻekiʻe, hiki ke hoʻonui pono i nā kope 1-10 o ka gene i hoʻopaʻa ʻia i loko o 1h, a ʻo ka hoʻonui ʻana he 10-100 mau manawa ma mua o ka PCR maʻamau.

(2) He pōkole ka manawa pane, ikaika ka kikoʻī, a ʻaʻole pono nā mea hana kūikawā.

Nā hemahema o LAMP:

(1) He kiʻekiʻe loa nā koi no nā primers.

(2) ʻAʻole hiki ke hoʻohana ʻia ka huahana i hoʻonui ʻia no ka cloning a me ka sequencing, akā hiki ke hoʻohana wale ʻia no ka hoʻoholo.

(3) Ma muli o kona naʻau ikaika, maʻalahi ka hana ʻana i nā aerosol, e hoʻopiʻi i nā hopena maikaʻi ʻole a pili i nā hopena hōʻike.

Shoʻonui hoʻoneʻe ʻana

ʻO ka Strand displacement amplification (SDA) kahi ʻenehana hoʻonui DNA isothermal in vitro e pili ana i ka hopena enzymatic i manaʻo mua ʻia e ka ʻepekema ʻAmelika Walker ma 1992.

Aia ka ʻōnaehana kumu o SDA i kahi endonuclease kaohi, kahi DNA polymerase me ka hana hoʻoneʻe strand, ʻelua mau ʻano kumu mua, dNTP, a me nā ion calcium a me ka magnesium a me nā ʻōnaehana pale.

Hoʻokumu ʻia ke kumu o ka strand displacement amplification ma ke kaʻina ʻike endonuclease hoʻololi kemika i hoʻololi ʻia ma nā kihi ʻelua o ka DNA target.Wehe ka endonuclease i ke āpau o ke kaula DNA ma kona kahua ʻike, a hoʻonui ka DNA polymerase i ke āpau 3′ End a hoʻololi i ke kaula DNA e hiki mai ana.

Hiki ke hoʻohui ʻia nā kaula hoʻokahi o DNA me nā primers a hoʻonui ʻia i nā kaula pālua e ka DNA polymerase.Hoʻomau mau ʻia kēia kaʻina hana, i hoʻonui maikaʻi ʻia ke kaʻina pahuhopu.

Nā pōmaikaʻi a me nā pōʻino o ka ʻenehana hoʻonui hoʻoneʻe strand

Nā pōmaikaʻi o SDA:

He kiʻekiʻe ka maikaʻi o ka amplification, pōkole ka manawa pane, ikaika ka kikoʻī, ʻaʻole pono nā mea hana kūikawā.

Nā hemahema o SDA:

ʻAʻole like nā huahana, a ua hana mau ʻia kekahi mau huahana i hoʻopaʻa ʻia i ka pōʻai SDA, a hiki ke ʻike ʻia e ka electrophoresis.

Rhoʻonui pōʻai olling

Hoʻolaha ʻia ka hoʻonui ʻia ʻana o ka pōʻai (RCA) ma ke kahakaha ʻana i ke ʻano o ke kope ʻana i ka DNA mai nā meaola pathogenic ma ka pōʻai ʻōwili.E pili ana ia i ka hoʻohana ʻana i ka DNA circular single-stranded ma ke ʻano he template ma kahi mahana mau, a me kahi DNA polymerase kūikawā (e like me Phi29) ) Ma lalo o ka hana o ka ʻōwili pōʻai DNA synthesis e hoʻokō ai i ka amplification o ka gene target.

Hiki ke hoʻokaʻawale ʻia ka RCA i ka hoʻonui laina a me ka hoʻonui exponential.Hiki i ka pono o ka linear RCA ke hiki i 10⁵manawa, a hiki i ka pono o ka exponential RCA hiki i 10⁹manawa.

ʻO ka hoʻokaʻawale maʻalahi, e like me ka mea i hōʻike ʻia ma ke kiʻi ma lalo nei, hoʻohana ka hoʻonui laina a i 1 kumu mua, ʻo ka hoʻonui exponential b he 2 primers.

Ua kapa ʻia ʻo Linear RCA he RCA hoʻokahi.Hoʻopili ʻia kahi primer i ka DNA pōʻai a hoʻonui ʻia e ka hana o DNA polymerase.ʻO ka huahana he laina laina laina me ka nui o nā kaʻina repetitive mau tausani o ka lōʻihi o ka loop hoʻokahi.

No ka mea pili mau ka huahana o ka laina RCA i ka hoʻomaka mua, ʻo ka maʻalahi o ka hoʻoponopono ʻana i ka hōʻailona he mea pono nui.

ʻO RCA Exponential, i ʻike pū ʻia ʻo Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), i ka RCA exponential, hoʻokahi primer e hoʻonui i ka huahana RCA, ka lua o ka primer hybridizes me ka RCA huahana a hoʻonui, a ua hoʻopaʻa ʻia ka mea pani i ka huahana RCA ʻO nā primers lalo e hoʻolōʻihi i ke kaula, a e hana hou i ka hoʻonui a me ka hoʻololi ʻana e hana i kahi huahana dendritic RCA.

ʻO nā pono a me nā pōʻino o ka hoʻonui ʻana i ka pōʻai nucleic acid amplification

Nā pōmaikaʻi o RCA:

ʻO ka naʻau kiʻekiʻe, ka kikoʻī maikaʻi a me ka hana maʻalahi.

Nā hemahema o RCA:

Nā pilikia hope i ka wā ʻike hōʻailona.I ka wā o ka hoʻololi ʻana o ka RCA, hiki i ka probe padlock uncirculated a me ka DNA template a i ʻole RNA o ka probe i hoʻopaʻa ʻole ke hana i kekahi mau hōʻailona hope. 

Nka hoʻonui ʻana i ke kaʻina ucleicacid

ʻO ka nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) kahi ʻenehana hou i kūkulu ʻia ma ke kumu o PCR.He hoʻonui hoʻomau a isothermal nucleic acid i alakaʻi ʻia e nā kumu mua me kahi kaʻina hoʻolaha T7.Hiki i ka ʻenehana ke hoʻonui i ka RNA template ma kahi o 109 mau manawa ma kahi o 2 mau hola, ʻo ia ka 1000 mau manawa kiʻekiʻe ma mua o ke ʻano PCR maʻamau a ʻaʻole koi i nā lako kūikawā.

Ua hoʻohana ʻia kēia ʻenehana no ka hoʻomaʻamaʻa wikiwiki ʻana i nā maʻi i ka wā i ʻike ʻia ai, a nui nā hui i kēia manawa e hoʻohana nei i kēia ʻano i nā pahu ʻike RNA.

ʻOiai hiki i ka RNA amplification ke hoʻohana i ka ʻenehana PCR reverse transcription, aia ka NASBA i kāna mau pono ponoʻī: hiki ke hana ʻia ma lalo o nā kūlana wela mau, a ʻoi aku ka paʻa a pololei ma mua o ka ʻenehana PCR kuʻuna.

Aia ka hopena ma 41 degere Celsius a koi aku i ka AMV (avian myeloblastosis virus) reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase a me nā kumu mua e hoʻopau ai.

ʻO ke kaʻina hana ka mea nui:

Aia i ka mua mua ke kaʻina hoʻohui o ka mea hoʻolaha T7.I ka wā o ka pane ʻana, hoʻopaʻa ka mua mua i ke kaula RNA a hoʻopaʻa ʻia e ka enzyme AMV e hana i kahi kaula pālua DNA-RNA.

Hoʻopau ʻo RNase H i ka RNA ma ke kaula pālua hybrid a mālama i ka DNA kaula hoʻokahi.

Ma lalo o ka hana a ka reverse primer a me ka AMV enzyme, ua hoʻokumu ʻia kahi kaula pālua DNA e loaʻa ana ka T7 promoter sequence.

Ma lalo o ka hana a T7 RNA polymerase, ua hoʻopau ʻia ke kaʻina hana transcription a ua hana ʻia ka nui o ka RNA target.

Nā pōmaikaʻi o ka NASBA:

(1) He kaʻina hoʻolaha T7 kona kumu mua, akā, ʻaʻohe kaʻina hoʻolaha T7 o ka haole ʻelua-stranded DNA a ʻaʻole hiki ke hoʻonui ʻia, no laila he kikoʻī kiʻekiʻe a me ka naʻau o kēia ʻenehana.

(2) Hoʻokomo pololei ʻo NASBA i ke kaʻina hana hoʻohuli i loko o ka hopena hoʻonui, e hōʻemi ana i ka manawa pane.

Nā hemahema o ka NASBA:

(1) ʻOi aku ka paʻakikī o nā mea hana.

(2) Pono ʻekolu ʻano enzymes e hoʻonui i ke kumu kūʻai.