ʻO ka PCR (polymerase chain reaction) kekahi o nā ʻenehana hoʻonui in-vitro DNA, me ka mōʻaukala ʻoi aku ma mua o 30 mau makahiki.

Ua hoʻokumu ʻia ka ʻenehana PCR e Kary Mullis o Cetus, USA i ka makahiki 1983. Ua noi ʻo Mullis i kahi patent PCR i ka makahiki 1985 a paʻi i ka pepa mua PCR kula ʻepekema ma ka makahiki hoʻokahi.Ua loaʻa ʻo Mullis i ka Nobel Prize in chemistry ma 1993 no kāna hana.

Nā Kumu Kumu o ka PCR

Hiki i ka PCR ke hoʻonui i nā ʻāpana DNA i ʻoi aku ma mua o hoʻokahi miliona mau manawa.Aia ke kumumanaʻo ma lalo o ka catalysis o DNA polymerase, me ka hoʻohana ʻana i ka DNA strand makua ma ke ʻano he laʻa a me ke kumu mua ma ke ʻano he hoʻomaka no ka hoʻonui.Hoʻopili ʻia ia i loko o ka vitro ma o nā ʻanuʻu e like me ka denaturation, annealing, a me ka hoʻonui.ʻO ke kaʻina hana o ke kaula DNA i hoʻohui ʻia i ka DNA template strand makua.

Ua māhele ʻia ke kaʻina hana PCR maʻamau i ʻekolu mau ʻanuʻu:

1.Denaturation: E hoʻohana i ka wela kiʻekiʻe e hoʻokaʻawale i nā kaula pālua DNA.Ua haki ka paʻa hydrogen ma waena o nā kaula pālua DNA i ka wela kiʻekiʻe (93-98 ℃).

2.Annealing: Ma hope o ka hoʻokaʻawale ʻia ʻana o ka DNA stranded ʻelua, e hoʻohaʻahaʻa i ka mahana i hiki i ka primer ke hoʻopaʻa i ka DNA stranded hoʻokahi.

3. Hoʻonui: Hoʻomaka ka DNA polymerase e synthesize i nā kaula hoʻohui me nā kaula DNA mai nā kumu mua i hoʻopaʻa ʻia ke hoʻohaʻahaʻa ʻia ka mahana.Ke hoʻopau ʻia ka hoʻonui ʻana, hoʻopau ʻia kahi pōʻai, a pālua ka helu o nā ʻāpana DNA

Hoʻopaʻa hou i kēia mau ʻanuʻu ʻekolu 25-35 mau manawa, e piʻi nui ka helu o nā ʻāpana DNA.

ʻO ka noʻonoʻo o ka PCR ʻo ia ka hiki ke hoʻolālā ʻia nā primers like ʻole no nā ʻano genes ʻokoʻa, i hiki ke hoʻonui ʻia nā ʻāpana gene target i kahi manawa pōkole.

I kēia manawa, hiki ke hoʻokaʻawale ʻia ka PCR i ʻekolu mau ʻāpana, ʻo ia hoʻi ka PCR maʻamau, fluorescent quantitative PCR a me digital PCR.

ʻO ka hanauna mua o PCR maʻamau

E hoʻohana i kahi mea hana hoʻonui PCR maʻamau e hoʻonui i ka gene i hoʻopaʻa ʻia, a laila e hoʻohana i ka electrophoresis gel agarose e ʻike ai i ka huahana, hiki ke hana i ka loiloi qualitative wale nō.

ʻO nā hemahema nui o ka PCR mua:

1. Prone i ka hoʻonui ʻole a me nā hopena maikaʻi ʻole.

2. He lōʻihi ka ʻike ʻana a paʻakikī ka hana.

3.Only qualitative ho'āʻo hiki ke hana

ʻO ka lua o ka hanauna PCR manawa maoli

ʻO ka PCR Real-Time, ka mea i kapa ʻia ʻo qPCR, hoʻohana i nā ʻōkuhi fluorescent e hiki ke hōʻike i ka holomua o ka ʻōnaehana pane, a nānā i ka hōʻiliʻili ʻana o nā huahana i hoʻonui ʻia ma o ka hōʻiliʻili ʻana o nā hōʻailona fluorescent, a e hoʻoponopono i nā hopena ma o ka pihi fluorescence.Hiki ke helu ʻia me ke kōkua o ka waiwai Cq a me ka pihi maʻamau.

Ma muli o ka hana ʻana o ka ʻenehana qPCR i kahi ʻōnaehana paʻa, ua hoʻemi ʻia ka probability o ka contamination, a hiki ke nānā ʻia ka hōʻailona fluorescence no ka ʻike quantitative, no laila ʻo ia ka mea i hoʻohana nui ʻia i ka hoʻomaʻamaʻa lāʻau lapaʻau a ua lilo i ʻenehana nui ma PCR.

Hiki ke hoʻokaʻawale ʻia nā mea fluorescent i hoʻohana ʻia i ka PCR fluorescent quantitative manawa maoli: TaqMan fluorescent probe, molecular beacons and fluorescent dye.

1) ʻO ka ʻimi ʻulaʻula TaqMan:

I ka hoʻonui ʻana i ka PCR, hoʻohui ʻia kahi ʻimi fluorescent kikoʻī i ka wā e hoʻohui ana i ʻelua o ka primer.He oligonucleotide ka probe, a ua kapa ʻia nā ʻaoʻao ʻelua me kahi hui fluorescent reporter a me kahi hui fluorescent quencher.

Ke paʻa ka ʻimi, ʻo ka hōʻailona fluorescent i hoʻokuʻu ʻia e ka hui mea hoʻolaha e hoʻopili ʻia e ka hui kinai;i ka wā o ka PCR amplification, ʻo ka hana exonuclease 5′-3′ o Taq enzyme e hoʻokaʻawale a hoʻohaʻahaʻa i ka ʻimi, e hana ana i ka pūʻulu fluorescent a me ka quencher Ua hoʻokaʻawale ʻia ka pūʻulu fluorescent, i hiki i ka ʻōnaehana nānā fluorescence ke loaʻa i ka hōʻailona fluorescence, ʻo ia hoʻi, i kēlā me kēia manawa e hoʻonui ʻia ka DNA strand me ka hoʻokumu ʻana o ka fluorescent me ka hoʻokumu ʻana o ka fluorescent. ka huahana PCR.

2) SYBR mea hoʻoulaula hou:

I loko o ka ʻōnaehana hopena PCR, ua hoʻohui ʻia ka nui o ka dye fluorescent SYBR.Ma hope o ka hoʻokomo ʻole ʻia ʻana o ka dye fluorescent SYBR i loko o ke kaula pālua DNA, hoʻopuka ia i kahi hōʻailona fluorescent.ʻO ka mole dye SYBR i hoʻokomoʻoleʻia i loko o ke kaulahao,ʻaʻole ia e hoʻokuʻu i kekahi hōʻailona fluorescent, ma laila e hōʻoiaʻiʻo ai i ka hōʻailona fluorescent ʻO ka hoʻonuiʻana i nā huahana PCR ua hui pūʻia me ka hoʻonuiʻana i nā huahana PCR.Hoʻopaʻa wale ʻo SYBR i ka DNA stranded ʻelua, no laila hiki ke hoʻohana ʻia ke kahe hoʻoheheʻe e hoʻoholo inā he kikoʻī ka hopena PCR.

3) Molecular beacon:

ʻO ia kahi ʻōniʻoniʻo oligonucleotide i hoʻopaʻa inoa ʻia ma kahi o 8 mau kumu ma ka hopena 5 a me 3.Hoʻohui pū ʻia nā kaʻina waikawa nucleic ma nā ʻaoʻao ʻelua, e paʻa ai ka pūʻulu fluorescent a me ka hui kinai.Hoʻopili, ʻaʻohe fluorescence e hana ʻia.

Ma hope o ka hana ʻia ʻana o ka huahana PCR, i ka wā o ke kaʻina hana annealing, ua hui pū ʻia ka ʻaoʻao waena o ka beacon molecular me kahi kaʻina DNA kikoʻī, a ua hoʻokaʻawale ʻia ka gene fluorescent mai ka gene quencher e hana i ka fluorescence.

ʻO nā hemahema nui o ka PCR lua-hanau:

Loaʻa ʻole ka naʻau, a ʻaʻole pololei ka ʻike ʻana i nā mea hoʻohālike haʻahaʻa.

Aia ka mana o ka waiwai hope, a hiki i ka hopena ke keakea.

Ke loaʻa nā PCR inhibitors i ka ʻōnaehana pane, hiki ke hoʻopili ʻia nā hopena ʻike.

PCR kikohoʻe ʻekolu

Heluhelu ʻia ka Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) i ka helu kope o ke kaʻina i hoʻopaʻa ʻia ma o ka ʻike ʻana i ka helu hope, a hiki ke hana i ka ʻike kikoʻī kikoʻī me ka hoʻohana ʻole ʻana i nā mana kūloko a me nā pihi maʻamau.

Hoʻohana ka PCR kikohoʻe i ka ʻike hope ʻana a ʻaʻole hilinaʻi i ka waiwai Ct (paepae pōʻai), no laila ʻoi aku ka liʻiliʻi o ka hopena PCR kikohoʻe e ka maikaʻi o ka hoʻonui ʻana, a ua hoʻomaikaʻi ʻia ka ʻae ʻana i ka PCR reaction inhibitors, me ke kiʻekiʻe o ka pololei a me ka reproducibility.

Ma muli o nā hiʻohiʻona o ka naʻau kiʻekiʻe a me ka pololei kiʻekiʻe, ʻaʻole maʻalahi ia e ka PCR reaction inhibitors, a hiki iā ia ke hoʻokō i ka quantification ʻoiaʻiʻo me ka ʻole o nā huahana maʻamau, ua lilo ia i kahi noiʻi a me ka hotspot noi.

E like me nā ʻano like ʻole o ka ʻāpana pane, hiki ke hoʻokaʻawale ʻia i ʻekolu mau ʻano nui: microfluidic, chip a me nā ʻōnaehana droplet.

1) Microfluidic digital PCR, mdPCR:

Ma muli o ka ʻenehana microfluidic, ua hoʻokaʻawale ʻia ke ʻano DNA.Hiki i ka ʻenehana microfluidic ke hoʻomaopopo i ka hōʻailona nano-upgrading a i ʻole ka hana ʻana o nā droplets liʻiliʻi, akā pono nā droplets i kahi ala adsorption kūikawā a laila hui pū me ka PCR reaction system.Ua ʻae ʻia ka mdPCR e nā ala ʻē aʻe e hoʻololi.

2) PCR kikohoʻe ma muli o Droplet, ddPCR:

E hoʻohana i ka ʻenehana hana hoʻoheheʻe wai i loko o ka aila e hana i ka hāpana i loko o nā droplets, a e puʻunaue i ka ʻōnaehana hopena e loaʻa ana nā molekala nucleic acid i mau tausani o nā kulu nanoscale, ʻaʻole i loaʻa i kēlā me kēia o ka nucleic acid target mole e ʻike ʻia, a i ʻole Loaʻa i hoʻokahi a i ʻole ka nui o ka nucleic acid target mole e hoʻāʻo ʻia.

3) PCR kikohoʻe ma muli o ka chip, cdPCR:

E hoʻohana i ka ʻenehana ala wai hoʻohui e kahakaha ai i nā microtubes a me nā microcavities ma luna o nā wafers silicon a i ʻole aniani quartz, a hoʻomalu i ke kahe o ka hopena ma o nā ʻāpana mana like ʻole, a puʻunaue i ka wai hāpana i nā nanometers o ka nui like i loko o nā pūnāwai hopena no ka PCR Reaction kikohoʻe e hoʻokō i ka helu piha.

ʻO nā hemahema nui o ke kolu o ka hanauna PCR:

He pipiʻi nā mea hana a me nā reagents.

He kiʻekiʻe ka pono o ka template.Inā ʻoi aku ka nui o ka template ma mua o ka nui microsystem, ʻaʻole hiki ke helu ʻia, a inā liʻiliʻi loa, e hoʻemi ʻia ka pololei helu.

Hiki ke hana ʻia nā mea maikaʻi hoʻopunipuni ke loaʻa ka hoʻonui ʻole kikoʻī.