Ke kamaʻilio nei nā mea a pau e pili ana i ke kumu o ka hoʻokolohua qRT-PCR, ka hoʻolālā mua, ka wehewehe ʻana i ka hopena, a me nā mea ʻē aʻe, akā manaʻo wau e kaʻana like me ʻoe i ka hana hoʻokolohua o qRT-PCR.He liʻiliʻi, akā pili i nā hopena.
Ma mua o ka hana ʻana i ka qRT-PCR, pono mākou e ʻike maopopo i kā mākou RNA ponoʻī a me nā ʻano hana.Ma hope o nā mea a pau, ke manaʻo nei kā mākou hana i ka loaʻa ʻana o nā hopena, ma mua o ka hoʻomaʻamaʻa wale ʻana.No laila ma mua o ka hana ʻana i ka qRT-PCR, pono mākou e hoʻoholo i nā pilikia e pili ana (no kekahi o ia mau mea pili wale iā SYBR).
1 ʻIke ʻoe ʻaʻole i hoʻohaʻahaʻa ʻia kāu RNA?
Hiki i ka NanoDrop 2000 ke ʻike i ka ʻike a me ka maʻemaʻe o RNA, akā ʻaʻole hiki ke ʻike i ka pono o RNA.
Hiki i ka waiwai RNA (RNA Intesity Number) ke hōʻike i ka pono o ka RNA, i ʻike ʻia e ka ʻōnaehana Agilent 2100 Bioanalyzer.
Fig. Kiʻikuhi kiʻi o nā waiwai RIN no nā laʻana RNA like ʻole (eukaryotes)
Eia nō naʻe, ʻaʻohe Agilent 2100 Bioanalyzer i nā laboratories.I kēia hihia, hiki iā mākou ke ʻike ma o ka formaldehyde gel, akā ʻo ke koi no ka nui o ka RNA he kiʻekiʻe, no laila ke ala wikiwiki loa e hoʻohana i ka electrophoresis gel maʻamau.Pono ia i loko o kahi nuclease-free environment, no laila pono e holoi i ka pahu electrophoresis, ʻōmole sol, gel bracket a hui pū me ka wai DEPC.He nuclease-free ka agarose (e like me ka wā i wehe hou ʻia), a pono e wehe hou ʻia ka Loading Buffer e like me ka hiki, me ka 1.2% gel.
E hoʻomaopopo he pono e hoʻoheheʻe ʻia ka gel, inā ʻaʻole ia e hana i nā ʻāpana like ʻole, e like me ka hōʻike ʻana ma ka laʻana 9 ma ke kiʻi.Inā kiʻekiʻe loa ka uila a holo lōʻihi paha e hoʻoulu i ka wela a hoʻohaʻahaʻa i ka RNA, no laila e hoʻomalu pono ʻia ka volta a me ka manawa.Eia kekahi, hiki i ka holo ʻana o ka gel ke hoʻoholo hou inā he koena DNA i loko o ka laʻana, a nānā i ka nui o nā kaula i hoʻopaʻa ʻia i loko o ka pūnāwai.
Kiʻi.ʻO ka ʻike electrophoresis gel o RNA
2 ʻIke paha ʻoe e pili ana i ka neʻe ʻana o kāu cDNA?
ʻO ka ʻike o nā kaikunāne nui i loko o ka hale hana ʻo ia ka cDNA o ka ʻōnaehana 20 ul i loaʻa i kēlā me kēia inversion e hoʻoheheʻe pololei ʻia 20X, aʻo nā kaikuahine post-doctoral i diluted 10X.Ke hilinaʻi mau nei au i ke kūlana.No ka mea ʻokoʻa ka maikaʻi o ka RNA i ʻōlelo ʻia e kēlā me kēia kanaka, ʻokoʻa ke kiʻekiʻe o ka hoʻohuli ʻana, a ʻaʻole paʻa ka ʻenehana hoʻohuli.
No laila, i kēlā me kēia manawa e loaʻa iaʻu ka cDNA hoʻohuli, e hoʻoheheʻe mua wau iā ia ma kahi o 3 mau manawa, a laila e hoʻohana i ka gene mālama hale e hana RT-PCR, ʻo ka nui o nā pōʻai he 25 mau pōʻai, e ʻike i ka ʻike kikoʻī, a laila e hoʻoholo i ka helu dilution hope.
3 ʻIke paha ʻoe he maʻalahi ka hoʻohana ʻana i kāu primers?
Hiki iā ia ke hele i ke kahe hoʻoheheʻe o qRT-PCR, akā mau ke kālā.No nā laboratories me ka nui ʻole o ke kālā, ke loaʻa iā lākou ka nui o nā primers, hiki iā lākou ke hoʻohana i ka RT-PCR maʻamau e ʻike inā he hui hoʻokahi a ʻike i ka kikoʻī o nā primers.Inā ʻaʻole liʻiliʻi ke kālā o ke keʻena hana, hiki ke ʻike ʻia ke ʻano kikoʻī o nā primers a pau ma o ka pihi hoʻoheheʻe.
4 ʻIke paha ʻoe ua kūpono kāu kūlana hoʻokolohua?
Pono e pale ʻia ʻo SYBR mai ke kukui ikaika, no laila e hoʻāʻo e hoʻopau i ke kukui o luna ke hoʻohui ʻia i ka SYBR reagent, a pono e hoʻohana i ke kukui pohihihi e hoʻopau ai.
E mālama iā SYBR ma 4°C.Ke hoʻohana ʻia, e hoʻohuli mālie i luna a i lalo e hui maikaʻi i mea e pale ai i ka huʻa, a mai vortex ikaika.
Makemake kekahi mau kaikaina e kaha kaha ma ka papa PCR no ka maka'u i ka hui 'ana i na la'ana, he hewa ia.No ka mea e pili ana kāu mau māka i ka hōʻiliʻili ʻana o nā hōʻailona fluorescent, ʻōlelo pinepine au i nā ʻōpio e hoʻohana i nā puke hoʻokolohua e kōkua i ka hoʻomanaʻo, e like me ka hōʻike ʻana ma lalo nei.
Kiʻi.qRT-PCR hōʻailona hoʻouka ʻana
5 Makemake ʻoe e hana pololei?
E ʻoluʻolu e ʻaʻahu i nā mīkina lima, e komo i nā mīkina lima, e ʻaʻahu i nā mīkina lima, a e ʻōlelo i nā mea koʻikoʻi ʻekolu manawa.
I mea e hōʻemi ai i ka ʻike ʻana o SYBR i ka mālamalama, makemake wau e hoʻohui mua i kahi template, e like me ka mea i hōʻike ʻia ma ke kiʻi ma lalo nei.Wahi a ka ʻike, ʻo ka hoʻohui ʻana i kahi ʻāpana liʻiliʻi o ka laʻana e hoʻopiʻi hewa ʻia.No laila, i mea e hōʻemi ai i ka hewa i hana ʻia ma ka hoʻohui ʻana i kahi helu liʻiliʻi o ka laʻana, maʻamau wau e pāpālua hou i ka hāpana, a pālua i ka nui i ka wā e hoʻohui ai i ka hāpana e hōʻemi i ka nui o ka H2O2 i hoʻohui ʻia.
Kiʻi.Kiʻikuhi schematic o ka hoʻouka ʻana o qRT-PCR
A laila hoʻonohonoho i ka ʻōnaehana qRT-PCR e like me kēia.
Kiʻi.kiʻi hoʻomākaukau ʻōnaehana qRT-PCR
NĀ MEA: Pono ke kaʻina hana hoʻonohonoho i ka hau.
Ma hope o ka hoʻohui ʻana i ka laʻana, e hoʻopili i ke kiʻi ʻoniʻoni hoʻopaʻa akaka.E ho'āʻo e hoʻopā ʻole i ka ʻili o ke kiʻi hoʻopaʻa akaka me kou mau lima, e hana wale mai ka hakahaka ma nā ʻaoʻao ʻelua o ke kiʻi.No ka mea, pili paha nā manamana lima i ka hōʻiliʻili ʻana o nā hōʻailona fluorescent.A laila, e hoʻohana i ka centrifuge e centrifuge wikiwiki no 10 s me ka māmā haʻahaʻa e pale aku i ka hāpana mai ke kau ʻana ma ka paia.
Nā huahana pili:
Ka manawa hoʻouna: Apr-28-2023
