Ma ke ʻano he mea hou i loko o ka hale hoʻokolohua, ʻaʻole ia he hana maikaʻi e nānā i nā mea kanu maikaʻi mai kahi pūʻulu o nā mea kanu me ka haʻahaʻa haʻahaʻa.ʻO ka mea mua, pono e unuhi ʻia ka DNA mai ka nui o nā laʻana, a laila e ʻike ʻia nā genes haole e ka PCR.Eia nō naʻe, ʻaʻole hiki ke hoʻoholo inā loaʻa nā ʻike i hala a i ʻole nā ​​​​ʻike hoʻopunipuni..He mea kōkua ʻole ke alo i ia kaʻina hana hoʻokolohua a me nā hopena?Mai hopohopo, ke aʻo aku nei ke kaikuaʻana iā ʻoe pehea e nānā pono ai i nā mea kanu transgenic maikaʻi a pololei.

KaʻAnuʻu 1

Hoʻolālā ʻike mua

E hoʻoholo i ka gene endogenous a me ka exogenous gene e ʻike ʻia e like me ka laʻana e hoʻāʻo ʻia, a koho i kahi ʻelele 100-500bp ʻelele ma ka gene no ka hoʻolālā mua.Hiki i nā kumu mua maikaʻi ke hōʻoia i ka pololei o nā hopena ʻike a hoʻopōkole i ka manawa ʻike (e ʻike i ka appendix no nā primers ʻike maʻamau).

'Ōlelo Aʻo: Pono nā kumu mua i hoʻolālā ʻia e hōʻoia i ka pololei, pololei a me ka palena ʻike o ka ʻike ma mua o ka ʻike nui.

KaʻAnuʻu 2

Hoʻolālā i ka protocol hoʻokolohua

Ka mana maikaʻi: E hoʻohana i ka DNA i hoʻomaʻemaʻe ʻia i loko o ka ʻāpana i hoʻopaʻa ʻia ma ke ʻano he maʻamau e hoʻoholo ai inā he maʻamau ka PCR ʻōnaehana a me nā kūlana.

Manaʻo maikaʻi ʻole/pākaʻa: E hoʻohana i ka hoʻohālikelike DNA a i ʻole ddH2O ʻaʻole i loaʻa ka ʻāpana i hoʻopaʻa ʻia ma ke ʻano he hoʻohālike e ʻike ai inā he kumu o ka haumia i loko o ka ʻōnaehana PCR.

Ka mana kuhikuhi i loko: e hoʻohana i ka hui mua/probe o ka gene endogenous o ka laʻana e hoʻāʻo ʻia e loiloi inā hiki ke ʻike ʻia ke ʻano e ka PCR.

Hoʻolaha:

Pono e hoʻonohonoho ʻia nā mana maikaʻi, ʻino/blank a me nā mana o loko no kēlā me kēia hoʻāʻo e loiloi i ka pono o nā hopena hoʻokolohua.

Hoʻomākaukau hoʻokolohua

Ma mua o ka hoʻohana ʻana, e nānā inā ua hui like ka hopena.Inā loaʻa ka ua, pono e hoʻoheheʻe ʻia a hui pū ʻia e like me nā kuhikuhi ma mua o ka hoʻohana ʻana.Pono e paipu ʻia ka hui ʻana o 2×PCR a hui pinepine me kahi micropipette ma mua o ka hoʻohana ʻana i mea e pale ai i ka hāʻawi ʻana i ka ion.

Hoʻolaha:

Wehe i ka puke a heluhelu pono, a hoʻomākaukau ma mua o ka hoʻokolohua e like me nā koi o ka manual.

KaʻAnuʻu 4

E hoʻomākaukau i ka ʻōnaehana hopena PCR

E like me ka protocol hoʻokolohua, hoʻohui i nā primers, H2O, a me 2×PCR hui like like, centrifuge a puʻunaue iā lākou i kēlā me kēia paipu hopena.

Hoʻolaha:

No ka hoʻāʻo nui a lōʻihi paha, ʻōlelo ʻia e hoʻohana i kahi ʻōnaehana hopena PCR i loaʻa i ka enzyme UNG, hiki ke pale maikaʻi i ka ʻino aerosol i hoʻokumu ʻia e nā huahana PCR.

KaʻAnuʻu 5

Hoʻohui i ka laʻana hoʻohālikelike

Ke hoʻohana nei i ka ʻenehana PCR Direct, ʻaʻohe pono no ka hoʻomaʻemaʻe ʻana i ka waika nucleic nucleic, hiki ke hoʻomākaukau ʻia ka laʻana i loko o 10 mau minuke, a hiki ke hoʻohui ʻia ka ʻōnaehana hopena PCR pili.

Hoʻolaha:

ʻOi aku ka maikaʻi o ka ʻike ʻana i ke ʻano o ka cleavage, a hiki ke hoʻohana ʻia ka huahana i loaʻa no nā hopena ʻike he nui.

5.1: Hoʻonui pololei i nā lau

E like me ka nui o ke kiʻi ma ka manual, e ʻoki i ka ʻiʻo lau me ke anawaena o 2-3mm a waiho i loko o ka PCR reaction system.

'Ōlelo Aʻo: E hōʻoia i ka hoʻokomo ʻia ʻana o nā ʻāpana lau i loko o ka solution reaction PCR, a mai hoʻohui i ka ʻiʻo lau nui.

5.2: ʻO ke ʻano hoʻokaʻawale lau

E ʻoki i ka ʻiʻo lau me ke anawaena o 5-7mm a waiho i loko o kahi paipu centrifuge.Inā koho ʻoe i nā lau oʻo, e ʻoluʻolu e hōʻole i ka hoʻohana ʻana i nā kiko o ka vein nui o ka lau.Pipette 50ul Buffer P1 lysate i loko o ka pahu centrifuge e hōʻoia e hiki i ka lysate ke hoʻokomo piha i ka ʻiʻo o ka lau, waiho i loko o kahi mea hoʻokele wela a i ʻole ka ʻauʻau metala, a lyse ma 95 ° C no 5-10 mau minuke.

Hoʻohui i ka 50ul Buffer P2 neutralization solution a hui maikaʻi.Hiki ke hoʻohana ʻia ka lysate hopena ma ke ʻano he laʻana a hoʻohui ʻia i ka ʻōnaehana hopena PCR.

'Ōlelo Aʻo: Aia ka nui o ka template ma waena o 5-10% o ka ʻōnaehana PCR, a ʻaʻole pono e ʻoi aku ma mua o 20% (no ka laʻana, ma kahi ʻōnaehana 20μl PCR, hoʻohui i ka 1-2μl o ka solution lysis, ʻaʻole ʻoi aku ma mua o 4μl).

KaʻAnuʻu 6

ka pane PCR

Ma hope o ka centrifuging i ka PCR reaction tube, waiho ʻia i loko o kahi mea hana PCR no ka hoʻonui ʻana.

Hoʻolaha:

Hoʻohana ka hopena i ka hoʻohālikelike hoʻomaʻemaʻe ʻole no ka hoʻonui ʻana, no laila ʻoi aku ka nui o nā pōʻai hoʻonui i 5-10 mau pōʻai ma mua o ka hoʻohana ʻana i ka template DNA maʻemaʻe.

KaʻAnuʻu 7

ʻO ka ʻike electrophoresis a me ka nānā ʻana i ka hopena

M: 100bp DNA Ladder

1\4: Keʻano DNA hoʻomaʻemaʻe

2\5: Ke ala PCR pololei

3\6: Ka hoomalu hakahaka

QC:

Pono nā hopena ho'āʻo o nā mana like ʻole i hoʻonohonoho ʻia i loko o ka hoʻokolohua e kūpono i kēia mau kūlana.A i ʻole, pono e nānā ʻia ke kumu o ka pilikia, a pono e hana hou ʻia ka hoʻāʻo ma hope o ka pau ʻana o ka pilikia.

Papa 1. Nā hopena ho'āʻo maʻamau o nā pūʻulu mana like ʻole

* Ke hoʻohana ʻia ka plasmid ma ke ʻano he mana maikaʻi, hiki i ka hopena hoʻāʻo gene endogenous ke hewa

Ka hopena o ka hoʻoholo:

A. ʻAʻole hiki ke unuhi ʻia ka DNA kūpono no ka ʻike PCR maʻamau mai ka hāpana a i ʻole ka DNA i unuhi ʻia i loko o ka PCR reaction inhibitors, a pono e unuhi hou ʻia ka DNA.

B. He maikaʻi ka hopena hoʻāʻo o ka gene endogenous o ka hāpana, a ʻo ka hopena hoʻāʻo o ka exogenous gene he mea maikaʻi ʻole, e hōʻike ana i ka DNA kūpono no ka ʻike PCR maʻamau i unuhi ʻia mai ka hāpana, a hiki ke hoʻoholo ʻia ʻaʻole ʻike ʻia ka gene XXX i ka hāpana.

C. He maikaʻi ka hopena hoʻāʻo o ka gene endogenous o ka hāpana, a he maikaʻi ka hopena hoʻāʻo o ka gene exogenous, e hōʻike ana ua unuhi ʻia ka DNA kūpono no ka ʻike PCR maʻamau mai ka hāpana, a aia ka DNA hāpana i ka gene XXX.Hiki ke hoʻokō hou ʻia nā hoʻokolohua hōʻoia.

KaʻAnuʻu 8

Hoʻolālā ʻike mua

Ma hope o ka hoʻokolohua, e hoʻohana i ka 2% sodium hypochlorite solution a me 70% ethanol solution e holoi i ka wahi hoʻokolohua e pale ai i ka haumia o ke kaiapuni.