一、E hoʻonui i ka naʻau o ka ʻōnaehana pane:

1. Hoʻokaʻawale i ka RNA kiʻekiʻe:

Loaʻa ka hana cDNA kūleʻa mai ka RNA kiʻekiʻe.Pono ka RNA kiʻekiʻe ma ka liʻiliʻi loa i ka lōʻihi a me ka ʻole o ka reverse transcriptase inhibitors e like me EDTA a i ʻole SDS.ʻO ka maikaʻi o ka RNA e hoʻoholo i ka nui o ka ʻike kikoʻī hiki iā ʻoe ke unuhi i ka cDNA.ʻO kahi ʻano hoʻomaʻemaʻe RNA maʻamau he ʻano hana hoʻokahi me ka hoʻohana ʻana i ka guanidine isothiocyanate/acid phenol.No ka pale ʻana i ka hoʻohaumia ʻana e ka nui o RNase, pono e mālama ʻia ka RNA i hoʻokaʻawale ʻia mai nā laʻana waiwai RNase (e like me ka pancreas) i loko o formaldehyde e mālama ai i ka RNA kiʻekiʻe, ʻoi aku no ka mālama lōʻihi.Ua hoʻohaʻahaʻa ʻia ka RNA i lawe ʻia mai ka ate ʻiole ma hope o ka mālama ʻia ʻana i loko o ka wai no hoʻokahi pule, ʻoiai ʻo ka RNA i unuhi ʻia mai ka ʻiole i hoʻopaʻa ʻia ma hope o ka mālama ʻana i ka wai no 3 mau makahiki.Eia kekahi, ʻoi aku ka maʻalahi o nā transcripts ma mua o 4 kb i ka hoʻohaʻahaʻa ʻia e nā trace RNases ma mua o nā transcripts liʻiliʻi.No ka hoʻonui ʻana i ka paʻa o nā laʻana RNA i mālama ʻia, hiki ke hoʻoheheʻe ʻia ka RNA i ka formamide deionized a mālama ʻia ma -70 ° C.Pono ka Formamide i hoʻohana ʻia no ka mālama ʻana i ka RNA me ka ʻole o ka ʻōpala RNA-degrading.Hiki ke mālama ʻia ka RNA mai ka pancreas i ka formamide no hoʻokahi makahiki.I ka hoʻomākaukau ʻana e hoʻohana i ka RNA, hiki iā ʻoe ke hoʻohana i kēia ʻano hana e hoʻoheheʻe ai i ka RNA: e hoʻohui i ka NaCl i 0.2M a me 4 manawa o ka nui o ka ethanol, e waiho i ka lumi wela no 3-5 mau minuke, a me ka centrifuge ma 10,000 × g no 5 mau minuke.

2. E hoʻohana i ka RNaseH-inactive (RNaseH-) reverse transcriptase:

Hoʻohui pinepine ʻia nā mea hoʻopaneʻe RNase e hoʻohuli i nā hopena transcription e hoʻonui i ka lōʻihi a me ka hua o ka synthesis cDNA.Pono e hoʻohui ʻia nā mea hoʻopaneʻe RNase i ka wā o ka hoʻololi ʻana o ka synthesis mua i ke alo o kahi buffer a me kahi mea hoʻohaʻahaʻa (e like me DTT), no ka mea, ʻo ke kaʻina hana ma mua o ka synthesis cDNA e hoʻopau i ka mea hoʻopaʻa, a laila e hoʻokuʻu i ka RNase paʻa i hiki ke hoʻohaʻahaʻa i ka RNA.ʻO nā mea hoʻopaneʻe Protein RNase wale nō ke pale i ka hoʻohaʻahaʻa ʻana o RNA e RNase A, B, C, a ʻaʻole e pale iā RNase ma ka ʻili, no laila e makaʻala ʻaʻole e hoʻokomo i ka RNase mai kou mau manamana lima me ka hoʻohana ʻana i kēia mau mea pale.

Hoʻololi ka transcriptase i ka huli ʻana o RNA i cDNA.Loaʻa iā M-MLV a me AMV ka hana RNaseH endogenous i kā lākou hana polymerase ponoʻī.ʻO ka hana RNaseH a me ka hana polymerase e hoʻokūkū kekahi i kekahi no ke kaula hybrid i hoʻokumu ʻia ma waena o ka RNA template a me ke kaula DNA primer a i ʻole cDNA extension strand, a hoʻohaʻahaʻa i ke kaula RNA i loko o ka RNA: DNA complex.ʻAʻole hiki ke hoʻohana hou ʻia ka template RNA i hoʻohaʻahaʻa ʻia e ka hana RNaseH ma ke ʻano he substrate kūpono no ka synthesis cDNA, e hōʻemi ana i ka hua a me ka lōʻihi o ka synthesis cDNA.No laila, pono e hoʻopau a hōʻemi paha i ka hana RNaseH o ka reverse transcriptase.

ʻO SuperScript Ⅱ reverse transcriptase, RNaseH- MMLV reverse transcriptase a me thermoScript reverse transcriptase, RNaseH- AMV, hiki ke loaʻa ka nui a me ka cDNA piha piha ma mua o MMLV a me AMV.Hoʻopili ʻia ka ʻike RT-PCR e ka nui o ka synthesis cDNA.ʻOi aku ka maʻalahi o ka ThermoScript ma mua o AMV.ʻO ka nui o nā huahana RT-PCR i kaupalena ʻia e ka hiki o ka reverse transcriptase e synthesize cDNA, ʻoi aku hoʻi i ka wā e hoʻopili ai i nā cDNA nui.Hoʻohālikelike ʻia me MMLV, ua hoʻonui nui ʻo SuperScripⅡ i ka hua o nā huahana RT-PCR lōʻihi.ʻO ka RNaseH-reverse transcriptase kekahi i hoʻonui i ka thermostability, no laila hiki ke hana ʻia ka hopena ma nā mahana ʻoi aʻe ma mua o ka 37-42°C maʻamau.Ma lalo o nā kūlana synthesis i manaʻo ʻia, e hoʻohana i ka oligo(dT) primer a me 10 μCi o [α-P]dCTP.Ua helu ʻia ka huina hua o ke kaula mua me ke ʻano o ka ua.Ua kālailai ʻia ka cDNA holoʻokoʻa me ka hoʻohana ʻana i nā kaula i hoʻokaʻawale ʻia a helu ʻia ma kahi gel agarose alkaline.

3. E hoʻokiʻekiʻe i ka wela incubation no ka unuhi ʻana:

ʻO kahi mahana incubation kiʻekiʻe e kōkua i ka wehe ʻana i ka ʻōnaehana lua RNA, e hoʻonui i ka hopena o ka hopena.No ka hapa nui o nā mamana RNA, ʻo ka hoʻoulu ʻana i ka RNA a me nā kumu mua ma 65°C me ka ʻole o ka buffer a i ʻole ka paʻakai, a ukali ʻia me ka hoʻomaloʻo wikiwiki ʻana i ka hau e hoʻopau i ka hapa nui o nā hale lua a hiki i nā primers ke nakinaki.Eia nō naʻe, loaʻa i kekahi mau hiʻohiʻona nā hale lua, ʻoiai ma hope o ka denaturation wela.Hiki ke hana ʻia ka hoʻonui ʻana i kēia mau mamana paʻakikī me ka hoʻohana ʻana i ka ThermoScript Reverse Transcriptase a kau i ka hopena transcription reverse i kahi wela kiʻekiʻe e hoʻomaikaʻi i ka amplification.Hiki ke hoʻonui ʻia ka ʻike kikoʻī o ka wela incubation kiʻekiʻe, ʻoi aku ka nui o ka wā e hoʻohana ʻia ai nā gene-specific primers (GSP) no ka synthesis cDNA (e nānā i ka Mokuna 3).Inā hoʻohana ʻoe i ka GSP, e hōʻoia i ka like o ka Tm o nā kumu mua me ka wela o ka incubation i manaʻo ʻia.Mai hoʻohana i ka oligo(dT) a me nā kumu mua ma luna o 60°C.Pono nā kumu mua i ka incubation ma 25 ° C no 10 mau minuke ma mua o ka hoʻonui ʻana i 60 ° C.Ma waho aʻe o ka hoʻohana ʻana i kahi mahana transcription kiʻekiʻe, hiki ke hoʻomaikaʻi ʻia ka kikoʻī ma ka hoʻololi pololei ʻana i ka hui ʻana o ka RNA/primer mai ka mahana denaturation 65 ° C i ka mahana incubation transcription reverse a hoʻohui i kahi hui ʻana o 2x i hoʻomehana ʻia (cDNA hot-start synthesis).Kōkua kēia ʻano hana i ka pale ʻana i ka hoʻopaʻa ʻana o ke kumu intermolecular e kū ana ma nā wela haʻahaʻa.Hiki ke maʻalahi ka hoʻololi ʻana i ka wela nui e pono ai no RT-PCR me ka hoʻohana ʻana i kahi mea hoʻokele wela.

Tth thermostable polymerase hana ma ke ano he DNA polymerase ma ke alo o Mg2+ a ma ke ano he RNA polymerase ma ke alo o Mn2+.Hiki ke mālama ʻia me ka mahana ma kahi wela o 65°C.Eia naʻe, ʻo ka loaʻa ʻana o Mn2+ i ka wā PCR e hōʻemi i ka hilinaʻi, ʻo ia ka mea e emi ai ka Tth polymerase no ka hoʻonui kiʻekiʻe kiʻekiʻe, e like me ka cloning o cDNA.Eia hou, he haʻahaʻa ko Tth ka pono o ka hoʻololi ʻana, e hōʻemi ana i ka naʻau, a, no ka mea hiki ke hoʻokō ʻia ka hoʻololi ʻana a me ka PCR me hoʻokahi enzyme, ʻaʻole hiki ke hoʻohana ʻia nā mana hoʻomalu me ka ʻole o ka hoʻololi ʻana e hoʻohālikelike i nā huahana amplification cDNA me ka DNA genomic e hoʻohaumia ai.Ua hoʻokaʻawale ʻia nā huahana amplification.

4. Nā mea hoʻohui e hoʻoikaika i ka hoʻololi ʻana:

Hoʻohui ʻia nā mea hoʻohui me ka glycerol a me DMSO i ka hopena synthesis mua-strand, hiki ke hōʻemi i ka paʻa o ka nucleic acid double-strand a wehe i ke ʻano lua o RNA.Hiki ke hoʻohui ʻia i ka 20% glycerol a i ʻole 10% DMSO me ka ʻole o ka hoʻopili ʻana i ka hana SuperScript II a i ʻole MMLV.Hiki i ka AMV ke ʻae a hiki i ka 20% glycerol me ka nele o ka hana.I mea e hoʻonui ai i ka naʻau o RT-PCR i ka SuperScriptⅡ reverse transcription reaction, 10% glycerol hiki ke hoʻohui ʻia a incubated ma 45°C.Inā hoʻohui ʻia ka 1/10 o ka huahana hoʻololi hoʻohuli i ka PCR, a laila ʻo ka glycerol i loko o ka hopena amplification he 0.4%, ʻaʻole lawa ia e pale i ka PCR.

5. Hana ʻia ʻo RNaseH:

ʻO ka mālama ʻana i nā hopena synthesis cDNA me RNaseH ma mua o ka PCR hiki ke hoʻonui i ka naʻau.No kekahi mau la'ana, ua mana'o 'ia 'o ka RNA i loko o ka cDNA synthesis reaction ke pale aku i ka ho'opa'a 'ana i nā huahana amplification, a ma ia hihia, hiki i ka lapa'au RNaseH ke ho'onui i ka na'au.ʻO ka maʻamau, pono ka mālama ʻana i ka RNaseH i ka wā e hoʻonui ai i nā kumu hoʻohālikelike cDNA piha lōʻihi, e like me ka low-copy tuberous scherosis II.No kēia laʻana paʻakikī, ua hoʻonui ka mālama RNaseH i ka hōʻailona i hana ʻia e SuperScript II a i ʻole AMV-synthesized cDNA.No ka hapa nui o nā pane RT-PCR, koho ʻia ka mālama ʻana iā RNaseH, no ka mea, ʻo ka PCR denaturation step ma 95°C e hydrolyzes maʻamau i ka RNA i loko o ka RNA: DNA complex.

6. Hoʻomaikaʻi i ke ʻano ʻike RNA liʻiliʻi:

He mea paʻakikī loa ka RT-PCR inā loaʻa nā RNA liʻiliʻi.Hoʻohui ʻia ʻo Glycogen ma ke ʻano he mea lawe i ka wā kaʻawale RNA e kōkua i ka hoʻonui ʻana i nā hua liʻiliʻi.Hiki ke hoʻohui ʻia ka glycogen RNase-free i ka manawa like me ka hoʻohui ʻana iā Trizol.Hiki ke hoʻoheheʻe ʻia ʻo Glycogen i ka wai a hiki ke mālama ʻia i loko o ke ʻano wai me RNA e kōkua i ka ua.No nā laʻana ma lalo o 50 mg o ka ʻiʻo a i ʻole 106 mau pūnaewele moʻomeheu, ʻo ka manaʻo i manaʻo ʻia o RNase-free glycogen he 250 μg/ml.

ʻO ka hoʻohui ʻana i ka BSA acetylated i ka hopena transcription reverse me ka hoʻohana ʻana i ka SuperScript II hiki ke hoʻonui i ka naʻau, a no ka liʻiliʻi o RNA, e hōʻemi ana i ka nui o SuperScript II a me ka hoʻohui ʻana i nā ʻāpana 40 o RNaseOut nuclease inhibitor hiki ke hoʻonui i ka pae o ka ʻike.Inā hoʻohana ʻia ka glycogen i ke kaʻina hana kaʻawale RNA, ʻōlelo ʻia e hoʻohui i ka BSA a i ʻole RNase inhibitor i ka wā e hoʻohana ai i ka SuperScript II no ka hoʻololi ʻana i ka unuhi.

二、E hoʻonui i ka kikoʻī RT-PCR

1. CND Asynthesis:

Hiki ke hoʻomaka ʻia ka synthesis cDNA mua me ka hoʻohana ʻana i ʻekolu mau ʻano like ʻole, ʻo ke kikoʻī pili e pili ana i ka nui a me ke ʻano o ka cDNA synthesized.

ʻO ke ʻano kumu mua maʻamau ka mea liʻiliʻi loa o nā ʻano ʻekolu.Hoʻopili nā kumu mua ma nā wahi he nui i loko o ka transcript, e hana ana i nā cDNA pōkole, hapa-lōʻihi.Hoʻohana pinepine ʻia kēia ʻano no ka loaʻa ʻana o nā kaʻina hopena 5′ a no ka loaʻa ʻana o cDNA mai nā template RNA me nā ʻāpana o ke kūkulu lua a i ʻole me nā kahua hoʻopau ʻaʻole hiki ke hoʻopili ʻia e ka reverse transcriptase.No ka loaʻa ʻana o ka cDNA lōʻihi loa, pono e hoʻoholo ʻia ka ratio o nā primers i ka RNA i kēlā me kēia laʻana RNA.ʻO ka hoʻomaka ʻana o ka hoʻomaka ʻana o nā primers random mai ka 50 a i ka 250 ng no ka hopena 20 μl.No ka mea, ʻo ka cDNA i hoʻohui ʻia mai ka RNA a pau me ka hoʻohana ʻana i nā primer random ʻo ia ka ribosomal RNA, koho maʻamau ka poly(A)+RNA ma ke ʻano hoʻohālike.

ʻOi aku ka kikoʻī o nā kumu mua o Oligo(dT) ma mua o nā kumu mua.Hoʻohui ia i ka huelo poly(A) i loaʻa ma ka hopena 3' o ka nui o nā mRNA eukaryotic.No ka mea, ʻo ka poly(A)+ RNA ma kahi o 1% a 2% o ka RNA a pau, ʻoi aku ka liʻiliʻi o ka nui a me ka paʻakikī o ka cDNA ma mua o nā kumu mua.Ma muli o kona kūlana kiʻekiʻe, ʻaʻole pono ka oligo(dT) i ka hoʻonui ʻana i ka ratio o RNA i nā primers a me ka poly(A) + koho.Manaʻo ʻia e hoʻohana i ka 0.5μg oligo(dT) no ka ʻōnaehana pane 20μl.ʻO ka oligo(dT)12-18 kūpono no ka hapa nui o RT-PCR.Hāʻawi ka ThermoScript RT-PCR System i ka oligo(dT)20 ma muli o kona kūpaʻa wela maikaʻi no nā mahana incubation kiʻekiʻe.

Gene specific primers (GSP) ʻo ia nā kumu kikoʻī loa no ka ʻanuʻu unuhi hope.ʻO GSP kahi oligonucleotide antisense hiki ke hoʻohui pono i ke kaʻina pahuhopu RNA, ʻaʻole like me nā primers random a i ʻole oligo(dT), kahi e hoʻopili ai i nā RNA āpau.ʻO nā lula like i hoʻohana ʻia no ka hoʻolālā ʻana i nā PCR primers e pili ana i ka hoʻolālā ʻana o GSP i nā hopena transcription hoʻohuli.Hiki i ka GSP ke kaʻina like me ka primer amplification e hoʻopili ana i ka 3′-nui loa o ka mRNA, a i ʻole hiki ke hoʻolālā ʻia ka GSP e hoʻopili i lalo o ka primer amplification huli.No kekahi mau kumuhana i hoʻonui ʻia, pono e hoʻolālā ʻia he ʻoi aku ma mua o hoʻokahi kumu mua antisense no ka RT-PCR kūleʻa no ka mea hiki ke pale ʻia ka hana lua o ka RNA i hoʻopaʻa ʻia.Manaʻo ʻia e hoʻohana i ka 1 pmol antisense GSP i kahi 20 μl first-strand synthesis reaction.

2. E hoʻokiʻekiʻe i ka wela incubation no ka unuhi ʻana:

I mea e hoʻohana pono ai i ka pono piha o ka kikoʻī GSP, pono e hoʻohana ʻia kahi transcriptase reverse me ka thermostability kiʻekiʻe.Hiki ke hoʻomoʻa ʻia nā transcriptases hoʻohuli thermotable i nā mahana kiʻekiʻe e hoʻonui ai i ka stringency.No ka laʻana, inā e hoʻopili ʻia kahi GSP ma 55°C, ʻaʻole e hoʻohana piha ʻia ka kikoʻī o ka GSP inā hoʻohana ʻia ʻo AMV a i ʻole M-MLV no ka unuhi hoʻohuli ʻana ma kahi kaula haʻahaʻa o 37°C.Eia naʻe, hiki ke hoʻololi ʻia ka SuperScript II a me ThermoScript ma 50 ° C a i ʻole ke kiʻekiʻe, kahi e hoʻopau ai i nā huahana kikoʻī ʻole i hana ʻia ma nā haʻahaʻa haʻahaʻa.No ka mea kiko'ī loa, hiki ke hoʻololi pololei ʻia ka hui ʻana o ka RNA/primer mai ka mahana denaturation 65 ° C a i ka wela hoʻoheheʻe ʻana o ka transcription a hoʻohui ʻia i kahi hui ʻana 2x i hoʻomehana ʻia (cDNA synthesis hot start).Kōkua kēia i ka pale ʻana i ka hoʻopaʻa ʻana o ke kumu intermolecular i nā wela haʻahaʻa.Hiki ke maʻalahi ka hoʻololi ʻana o ka wela i makemake ʻia no RT-PCR me ka hoʻohana ʻana i kahi kaʻa kaʻa wela.

3. E hoemi ana i ka ino DNA genomic:

ʻO kahi pilikia i loaʻa me RT-PCR ʻo ka hoʻohaumia ʻana o ka DNA genomic i ka RNA.ʻO ka hoʻohana ʻana i kahi ala hoʻokaʻawale RNA maikaʻi, e like me Trizol Reagent, e hōʻemi i ka nui o ka DNA genomic e hoʻohaumia i ka hoʻomākaukau RNA.No ka pale ʻana i nā huahana i loaʻa mai ka genomic DNA, hiki ke mālama ʻia ka RNA me ka amplification-grade DNase I e wehe i ka DNA haumia ma mua o ka hoʻohuli ʻana i ka palapala.Ua hoʻopau ʻia ka digestion ʻo DNase I ma ka hoʻomoʻa ʻana i nā laʻana ma 2.0 mM EDTA no 10 mau minuke ma 65 ° C.Hiki iā EDTA ke hoʻokaʻawale i nā ion magnesium, e pale ana i ka RNA hydrolysis e pili ana i ka magnesium ion i nā wela kiʻekiʻe.

I mea e hoʻokaʻawale ai i ka cDNA i hoʻonui ʻia mai ka hoʻohaumia ʻana i nā huahana hoʻonui DNA genomic, hiki ke hoʻolālā ʻia nā primers i kēlā me kēia anneal e hoʻokaʻawale i nā exons.ʻOi aku ka pōkole o nā huahana PCR i loaʻa mai ka cDNA ma mua o nā mea i loaʻa mai ka DNA genomic i hoʻohaumia ʻia.Eia hou, ua hana ʻia kahi hoʻokolohua hoʻomalu me ka ʻole o ka hoʻololi ʻana i ke kope ma kēlā me kēia RNA template e hoʻoholo ai inā i loaʻa mai kahi ʻāpana i loaʻa mai ka genomic DNA a i ʻole cDNA.ʻO ka huahana PCR i loaʻa me ka ʻole o ka transcription hoʻohuli i loaʻa mai ka genome.