1. ʻIke kumu (inā makemake ʻoe e ʻike i ka ʻāpana hoʻokolohua, e ʻoluʻolu e hoʻololi pololei i ka ʻāpana ʻelua)
Ma ke ʻano he hopena derivative o PCR maʻamau, ʻike nui ʻo PCR manawa maoli i ka hoʻololi ʻana o ka nui o ka huahana amplification i kēlā me kēia pōʻai o ka PCR amplification reaction i ka manawa maoli ma o ka hoʻololi ʻana o ka hōʻailona fluorescence, a me ka helu helu ʻana i ke kumu hoʻomaka ma o ka pilina ma waena o ka waiwai ct a me ka pihi maʻamau.
ʻO nā ʻikepili kikoʻī o RT-PCRlaina kumu, paepae fluorescenceaCt waiwai.
| kumu: | ʻO ka waiwai fluorescence o ka pōʻaiapuni 3-15 ʻo ia ka baseline (baseline), ʻo ia ke kumu o ka hewa i kekahi manawa o ke ana. |
| Paepae (paepae): | E pili ana i ka palena ʻike fluorescence i hoʻonoho ʻia ma kahi kūpono ma ka ʻāpana ulu exponential o ka pihi hoʻonui, ma ke ʻano he 10 mau manawa o ka deviation maʻamau o ka baseline. |
| Waiwai CT: | ʻO ia ka helu o nā pōʻai PCR i ka wā e hiki ai ka waiwai fluorescence i kēlā me kēia paipu hopena i ka paepae. Hoʻohālikelike ʻia ka waiwai Ct i ka nui o ka laʻana mua. |
Nā ʻano lepili maʻamau no RT-PCR:
| ʻano hana | pono | hemahema | laulā o ka noi |
| SYBR GreenⅠ | Hoʻohana ākea, ʻoluʻolu, kūʻai a maʻalahi | He kiʻekiʻe nā koi kumu mua, kūpono i nā pūʻulu kikoʻī ʻole | He kūpono ia no ka nānā ʻana i ka nui o nā ʻano genes i manaʻo ʻia, ka noiʻi ʻana i ka hōʻike gene, a me ka noiʻi ʻana i nā holoholona transgenic recombinant a me nā mea kanu. |
| TaqMan | Kūlana maikaʻi a me ka hoʻihoʻi kiʻekiʻe | He kiʻekiʻe ke kumukūʻai a kūpono wale no nā pahuhopu kikoʻī. | ʻO ka ʻike ʻana i ka pathogen, ka noiʻi ʻana i ka lāʻau kūʻē i ka lāʻau, ka loiloi ʻana i ka pono o ka lāʻau, ka ʻike o nā maʻi genetic. |
| molecular beacon | Kūlana kiʻekiʻe, fluorescence, haʻahaʻa haʻahaʻa | He kiʻekiʻe ke kumukūʻai, kūpono wale ia no kahi kumu kikoʻī, paʻakikī ka hoʻolālā, a kiʻekiʻe ke kumukūʻai. | Hoʻopili kikoʻī kikoʻī, kānana SNP |
2. Nā ʻanuʻu hoʻokolohua
2.1 E pili ana i ka hui hoʻokolohua- pono e nui nā pūnāwai i loko o ka hui, a pono e loaʻa nā hana hou olaola.
| ① | Ka mana hakahaka | Hoʻohana ʻia e ʻike i ke kūlana o ka ulu ʻana o ke kelepona ma nā hoʻokolohua |
| ② | ʻO ka mana ʻino ʻo siRNA (ke kaʻina siRNA kikoʻī ʻole) | E hōʻike i ke kikoʻī o ka hana RNAi.Hiki i ka siRNA ke hoʻoulu i ka pane koʻikoʻi koʻikoʻi ʻole ma ke ʻano o 200nM. |
| ③ | Hoʻomalu Reagent Transfection | E hoʻokaʻawale i ka ʻawaʻawa o ka transfection reagent i nā cell a i ʻole ka hopena i ka hōʻike ʻana o ka gene target. |
| ④ | siRNA kū'ē i ka gene i hoʻopaʻa ʻia | E hoʻokuʻu i ka hōʻike o ka gene target |
| ⑤ (koho) | siRNA maikaʻi | Hoʻohana ʻia e hoʻoponopono i ka ʻōnaehana hoʻokolohua a me nā pilikia hana |
| ⑥ (koho) | ʻO ka mana fluorescent siRNA | Hiki ke ʻike ʻia ka maikaʻi o ka neʻe ʻana o ke kelepona me kahi microscope |
2.2 Nā loina o ka hoʻolālā mua
| Nui ʻāpana i hoʻonui ʻia | ʻOi aku ka maikaʻi ma 100-150bp |
| Ka lōʻihi mua | 18-25bp |
| GC maʻiʻo | 30%-70%, ʻoi aku ka maikaʻi o 45%-55% |
| Tm waiwai | 58-60 ℃ |
| Kaʻina | E pale i ka T/C mau;A/G mau |
| 3 kaʻina hope | Hōʻalo i ka waiwai GC a i ʻole ka waiwai AT;ʻoi aku ka maikaʻi o ka base terminal G a i ʻole C;ʻoi aku ka maikaʻi e pale iā T |
| Hoʻohui | E hōʻalo i nā kaʻina hoʻohui ʻoi aku ma mua o 3 kumu i loko o ka primer a i ʻole ma waena o ʻelua mau kumu |
| kikoo | E hoʻohana i ka ʻimi blast e hōʻoia i ka kikoʻī kikoʻī |
①SiRNA he ʻano-specific, a ʻokoʻa nā kaʻina o nā ʻano like ʻole.
②Hoʻopili ʻia ʻo SiRNA i loko o ka pauka maloʻo maloʻo, hiki ke mālama paʻa ʻia no 2-4 mau pule ma ke ana wela.
2.3 Mea hana a reagents e pono e hoomakaukau mua
| Primer (kuʻi kūloko) | Aia i mua a i hope ʻelua |
| Nā kumu mua | Aia i mua a i hope ʻelua |
| Target Si RNA (3 ʻāpana) | ʻO ka maʻamau, e hana ka hui i nā ʻāpana 3, a laila koho i kekahi o nā ʻekolu e RT-PCR |
| Kit Hoʻololi | Lipo2000 etc. |
| RNA Rapid Extraction Kit | No ka lawe ʻana i ka RNA ma hope o ka lawe ʻana |
| Kiko Huli Huli wikiwiki | no ka cDNA synthesis |
| PCR Amplification Kit | 2×Super SYBR Green qPCR Master Mix |
2.4 E pili ana i nā pilikia e pono e nānā ʻia ma nā ʻanuʻu hoʻokolohua kikoʻī:
①siRNA kaʻina hoʻololi
1. No ka plating, hiki iā ʻoe ke koho i ka pā 24-well plate, 12-well plate a i ʻole 6-well plate (ʻo ka awelika RNA i manaʻo ʻia i kēlā me kēia pūnāwai o kahi pā 24-well ma kahi o 100-300 ng/uL), a ʻo ka nui o ka transfection density o nā cell a hiki i 60 % -80% a i ʻole.
2. ʻO nāʻanuʻu hoʻololi a me nā koi kiko'ī e pili pono ana i nā kuhikuhi.
3. Ma hope o ka hoʻololi ʻana, hiki ke hōʻiliʻili i nā laʻana i loko o 24-72 mau hola no ka ʻike mRNA (RT-PCR) a i ʻole ka ʻike protein i loko o 48-96 hola (WB)
② kaʻina unuhi RNA
1. Kāohi i ka haumia e nā enzymes exogenous.Hoʻopili nui ia i ke komo ʻana i nā masks a me nā mīkina lima;me ka hoʻohana ʻana i nā ʻōlelo aʻoaʻo pipette sterilized a me nā paipu EP;ʻo ka wai i hoʻohana ʻia ma ka hoʻokolohua pono ʻo RNase-Free.
2. Manaʻo ʻia e hana ʻelua e like me ka mea i manaʻo ʻia i loko o ka pahu lawe wikiwiki, e hoʻomaikaʻi maoli i ka maʻemaʻe a me ka hua.
3. ʻAʻole pono e pā ka wai ʻōpala i ke kolamu RNA.
③ Ka helu RNA
Ma hope o ka unuhi ʻia ʻana o ka RNA, hiki ke helu pololei ʻia me Nanodrop, a ʻo ka liʻiliʻi o ka heluhelu ʻana e like me 10ng/ul.
④E hoʻohuli i ke kaʻina hana unuhi
1. Ma muli o ka ʻike kiʻekiʻe o RT-qPCR, pono e hana ʻia ma kahi o 3 mau pūnāwai like ʻole no kēlā me kēia laʻana i mea e pale ai i ka Ct ma hope mai ka ʻokoʻa ʻana a i ʻole ka nui o ka SD no ka loiloi helu.
2. Mai maloʻo a hoʻolulu i ka Master mix i nā manawa a pau.
3. Pono e ho'ololi 'ia kēlā me kēia paipu me ka piko hou!Mai hoʻohana mau i ka piko pipette e hoʻohui i nā laʻana!
4. ʻO ke kiʻi i hoʻopili ʻia i ka pā 96-well ma hope o ka hoʻohui ʻana i ka hāpana pono e hoʻomaʻamaʻa ʻia me kahi pā.ʻOi aku ka maikaʻi o ka centrifuge ma mua o ka kau ʻana ma luna o ka mīkini, i hiki i ka wai ma ka paia o ka paipu ke kahe i lalo a wehe i nā ʻōhū ea.
⑤Ka helu ʻana maʻamau
| ʻAʻohe manawa o ka ulu ʻana o ka logarithmic | Kiʻekiʻe paha o ka laʻana |
| ʻAʻohe waiwai CT | Nā ʻanuʻu hewa no ka ʻike ʻana i nā hōʻailona fluorescent; ka hoʻohaʻahaʻa ʻana o nā primers a i ʻole nā probes - hiki ke ʻike ʻia kona kūpaʻa e ka PAGE electrophoresis; lawa ʻole ka nui o ka template; ka hoʻohaʻahaʻa ʻana i nā mamana - pale i ka hoʻokomo ʻana o nā mea haumia a me ka hoʻoheheʻe pinepine ʻana a me ka hoʻoheheʻe ʻana i ka hoʻomākaukau ʻana; |
| Ct>38 | Haʻahaʻa amplification pono;He lōʻihi loa ka huahana PCR;hoʻohaʻahaʻa ʻia nā ʻāpana hana like ʻole |
| kaha hoʻonui laina | Hiki ke hoʻohaʻahaʻa ʻia ka ʻimi noiʻi e nā pōʻai maloʻo maloʻo a i ʻole ka ʻike lōʻihi ʻana i ka mālamalama |
| Nui loa ka ʻokoʻa o nā lua lua | ʻAʻole i hoʻoheheʻe ʻia ka hoʻonā hopena a ʻaʻole i hui pū ʻia ka hopena hopena;ua haumia ka ʻauʻau wela o ka mea hana PCR e nā mea fluorescent |
2.5 E pili ana i ka ʻikepili ʻikepili
Hiki ke hoʻokaʻawale ʻia ka ʻikepili ʻikepili o qPCR i ka helu pili a me ka helu piha.No ka laʻana, nā cell i loko o ka hui lapaʻau i hoʻohālikelike ʻia me nā cell i ka pūʻulu hoʻomalu,
ʻEhia mau manawa e hoʻololi ai ka mRNA o ka gene X, ʻo ia ka helu pili;i kekahi helu o nā pūnaewele, ka mRNA o ka X gene
ʻEhia mau kope, ʻo ka helu piha kēia.ʻO ka mea maʻamau ka mea a mākou e hoʻohana nui ai i ka hale hana ʻo ia ke ʻano quantitative pili.ʻO ka maʻamau,ke ala 2-ΔΔcthoʻohana nui ʻia i nā hoʻokolohua, no laila e hōʻike kikoʻī ʻia kēia ala ma aneʻi.
2-ΔΔct ala: ʻO ka hopena i loaʻa ʻo ia ka ʻokoʻa o ka hōʻike ʻana o ka gene i hoʻopaʻa ʻia i loko o ka pūʻulu hoʻokolohua e pili ana i ka gene i hoʻopaʻa ʻia i ka pūʻulu mana.Pono ʻia ka hoʻonui ʻia ʻana o ka gene i hoʻopaʻa ʻia a me ka gene reference i loko e kokoke i 100%, a ʻaʻole pono e ʻoi aku ka ʻoi aku o ka 5%.
Penei ke ano helu.
Δct pūʻulu hoʻomalu = ct waiwai o ka gene i hoʻopaʻa ʻia i loko o ka pūʻulu hoʻomalu - ct waiwai o ka moʻo kuhikuhi kūloko i ka pūʻulu mana
Δct pūʻulu hoʻokolohua = ct waiwai o ka gene i manaʻo ʻia i loko o ka hui hoʻokolohua - ct waiwai o ka gene kuhikuhi kūloko i ka hui hoʻokolohua
ΔΔct=Δct hui hoʻokolohua-Δct pūʻulu mana
ʻO ka hope, e helu i ka nui o ka ʻokoʻa i ka pae hōʻike:
Hoʻololi Fold=2-ΔΔct (e pili ana i ka hana excel ʻo POWER)
Nā huahana pili:
Ka manawa hoʻouna: Mei-20-2023
