Ke kumu hoʻolālā kumu mua (99% hiki ke hoʻoponopono ʻia nā pilikia)
1. Ka lōʻihi mua: Pono ka puke haʻawina i 15-30bp, ma kahi o 20bp maʻamau.ʻOi aku ka maikaʻi o ke kūlana maoli i ka 18-24bp e hōʻoia i ka kikoʻī, akā ʻoi aku ka lōʻihi o ka maikaʻi, ʻoi aku ka lōʻihi o ka primer e hoʻemi i ka kikoʻī, a hoʻemi i ka hua.
2. ʻO ka nui o ka hoʻonui nui: 200-500bp kūpono, a hiki ke hoʻonui ʻia ka ʻāpana i 10kb ma lalo o nā kūlana kikoʻī.
3. Ke kumu kumu: He 40-60% ka maʻiʻo o G+C, ʻaʻole maikaʻi ka hopena hoʻonui G+C, ʻoi aku ka maʻalahi o ka G+C e ʻike i nā pūʻulu kikoʻī ʻole.ʻOi aku ka maikaʻi o ka puʻunaue ʻana i ka ATGC me ka pale ʻole ʻana i nā puʻupuʻu ʻoi aku ma mua o 5 purine a i ʻole pyrimidine nucleotides.Multi-gc no ka hopena 5' a me nā kaʻina waena e hoʻonui i ke kūpaʻa, e pale i ka GC waiwai ma ka hopena 3', ʻaʻohe GC no nā kumu 3 hope loa, a i ʻole GC no 3 o nā kumu 5 hope loa.
4. E pale i ka hana lua ma na kumu mua, a e pale i ka hoopiha ana ma waena o elua primers, oi loa aku ka hoopiha ana ma ka 3 'hopena, i ole ia, e hanaia ka dimer primer a e hanaia na kaula i hoonuiia ole.
5. Pono e hoʻopili pono nā kumu ma ka hope 3 o nā kumu mua, ʻoi aku ka nui o nā kumu hope a me ka penultimate e pale aku ai i ka hemahema o ka PCR ma muli o nā kumu hoʻopaʻa ʻole.
6. Loaʻa a hiki ke hoʻohui ʻia nā kumu mua me nā pae hoʻokaʻawale kūpono, a ʻoi aku ka maikaʻi o ka hoʻonui ʻia ʻana o ke kaʻina pahuhopu i nā wahi hoʻokaʻawale kūpono, he mea maikaʻi loa ia no ka nānā ʻana i ka cleavage a i ʻole ka cloning molecular.
7. Ka kiko'ī o nā mea hoʻomaka: ʻaʻole pono e loaʻa i nā mea hoʻomaka ka homology maopopo me nā kaʻina ʻē aʻe i loko o ka waihona nucleic acid sequence database.
8. E aʻo i ka hoʻohana ʻana i nā polokalamu: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Ke hana maikaʻi nei kēia hoʻolālā pūnaewele).
Hiki i ka ʻike ma luna ke hoʻoponopono ma kahi o 99% o nā pilikia hoʻolālā kumu.
E kāohi i nā kikoʻī o ka hoʻolālā primer
1. Ka lōʻihi mua
ʻO ka lōʻihi kumu mua he 18-30 kumu.Ma keʻano laulā,ʻo ka mea nui loa e hoʻoholo ai i ka mahana annealing o ka primer ka lōʻihi o ka primer.Hoʻohana maʻamau ʻia ka mahana annealing o ka primer (waiwai Tm -5 ℃), a hoʻohana pololei kekahi i ka waiwai Tm.Hiki ke hoʻohana ʻia nā ʻōkuhi ma lalo nei no ka helu ʻana i ka mahana annealing o nā primers.
Ke emi ka lōʻihi o ka primer ma mua o 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Ke ʻoi aku ka lōʻihi o ka primer ma mua o 20bp: 62.3 ℃ + 0.41 ℃ (%GC) -500/lōʻihi-5 ℃
Eia kekahi, hiki ke hoʻohana ʻia nā polokalamu he nui no ka helu ʻana i ka mahana annealing, ʻokoʻa ke kumu helu helu, no laila i kekahi manawa he wahi liʻiliʻi ka waiwai i helu ʻia.No ka hoʻokō ʻana i nā hopena PCR, hoʻohana ʻia nā kumu mua pōkole e hōʻoia i nā mahana annealing ʻaʻole i emi ma lalo o 54 ℃ no ka maikaʻi a me ka kikoʻī.
ʻO ka holoʻokoʻa, hoʻonui ʻia ka kikoʻī kumu ma ka helu ʻehā no kēlā me kēia nucleotide hou, no laila ʻo ka lōʻihi haʻahaʻa loa no ka hapa nui o nā noi he 18 nucleotides.ʻAʻole koʻikoʻi ka palena kiʻekiʻe o ka lōʻihi o ka primer, pili nui i ka hopena hopena.Ma muli o ka entropy, ʻoi aku ka lōʻihi o ka mea mua, ʻo ia ka haʻahaʻa o ka mea e hoʻopili ai e hoʻopaʻa i ka DNA i manaʻo ʻia e hana i kahi maʻa paʻa paʻa pālua no ka DNA polymerase e hoʻopaʻa ai.
I ka hoʻohana ʻana i nā lako polokalamu no ka hoʻolālā ʻana i nā primers, hiki ke hoʻoholo ʻia ka lōʻihi o nā primers e ka waiwai TM ma ka huli ʻana, ʻoi aku hoʻi no nā primers o ka fluorescence quantitative PCR, TM=60 ℃ a i ʻole pono e hoʻomalu ʻia.
2.GC maʻiʻo
ʻO ka maʻamau, ʻo ka maʻiʻo o G + C i nā kaʻina kumu mua he 40% ~ 60%, a pono e hoʻohui ʻia ka maʻiʻo GC a me ka waiwai Tm o kahi pālua o nā primers.Inā he GC koʻikoʻi a AT ke kumu, hiki ke hoʻohui ʻia ka nui kūpono o ka huelo A, T a G a me C i ka hopena 5 o ka primer.
3. ʻO ke ana wela
Pono ka mahana annealing ma lalo o 5 ℃ ma mua o ka mahana unchain.Inā liʻiliʻi ka helu o nā kumu kumu, hiki ke hoʻonui ʻia ka mahana annealing, hiki ke hoʻonui i ka kikoʻī o ka PCR.Inā nui ka helu o nā kumu, hiki ke hoʻemi pono ʻia ka mahana annealing.ʻO ka ʻokoʻa wela o ka annealing ma waena o nā kumu mua o 4 ℃ ~ 6 ℃ ʻaʻole ia e hoʻopilikia i ka hua PCR, akā ʻoi aku ka maikaʻi o ka mahana annealing o kahi pālua o nā primers, hiki ke ʻokoʻa ma waena o 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. E pale aku i ka lua o ka hale o ka la'ana ho'onui
ʻOi aku ka maikaʻi e pale aku i ka ʻāpana kūkulu lua o ka laʻana i ke koho ʻana i ka ʻāpana i hoʻonui ʻia.Hiki ke wānana a manaʻo ʻia ke ʻano paʻa lua o ka ʻāpana i manaʻo ʻia e nā polokalamu kamepiula kūpono, he mea kōkua ia no ke koho ʻana i ka laʻana.Hōʻike nā hualoaʻa hoʻokolohua ʻaʻole i kūleʻa pinepine ka hoʻonui ʻana ke emi ka ikehu manuahi (△G) o ka ʻāina e hoʻonui ʻia ma lalo o 58.6lkJ/mol.
5. Kūlike ʻole me ka DNA pahuhopu
I ka nui o ke kaʻina DNA target i hoʻonui ʻia, hiki i kahi kumu mua ke hoʻopaʻa i nā ʻāpana he nui o ka DNA i hoʻopaʻa ʻia, e hopena i nā ʻāpana he nui i ka hopena.I kēia manawa pono e hoʻohana i ka hoʻāʻo polokalamu BLAST, pūnaewele:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.E koho Align ʻelua kaʻina (bl2seq).
Hiki ke hoʻololi ʻia ka hoʻopili ʻana i nā kaʻina kumu mua i ka ʻāpana 1 a me nā kaʻina DNA e kuhikuhi i ka ʻāpana 2, a ua helu ʻo BLAST i nā mea hoʻohui, antisense, a me nā mea ʻē aʻe, no laila ʻaʻole pono nā mea hoʻohana e ʻike inā he mau kaulahao manaʻo nā kaulahao ʻelua.Hiki iā ʻoe ke hoʻokomo i ka helu GI inā ʻike ʻoe i ka helu GI o ke kaʻina ma ka waihona, no laila ʻaʻole pono ʻoe e hoʻopili i kahi ʻāpana nui o ke kaʻina.ʻO ka hope, kaomi iā Align at 3 e ʻike inā he nui nā pae homologous o ka primer i ka DNA i manaʻo ʻia.
6. Puhi kumu
ʻO ka 3 'hopena o ka primer kahi e hoʻomaka ai ka hoʻonui, no laila he mea nui e pale i nā mismatches mai ka hoʻomaka ʻana ma laila.ʻAʻole pono e ʻoi aku ka hopena 3 ma mua o 3 G a i ʻole C, no ka mea, ʻo ia ke kumu e kuhi hewa ʻia ai ke kumu mua ma ka māhele hoʻonui G+C.ʻAʻole hiki i ka hopena 3 ke hana i kekahi ʻano hana lua, koe wale nō i nā hopena PCR kūikawā (AS-PCR), ʻaʻole hiki ke hoʻohālikelike ʻia ka hopena 3' o ka primer.No ka laʻana, ina ka encoding māhele 'āina ua amplified, ka 3 'hopena o ka primer e ole e hoopau i ke kolu o ke kūlana o ka codon, no ka mea, o ke kolu o ka codon mea prone e degenerate, e pili ana i ka specificity a me ka pono o ka amplification.I ka hoʻohana ʻana i nā kumu hoʻohui, e nānā i ka papa hoʻohana codon, e hoʻolohe i ka makemake olaola, mai hoʻohana i nā primers hoʻohui i ka hopena 3′, a e hoʻohana i kahi kiʻekiʻe kiʻekiʻe o nā primers (1uM-3uM).
7. Ka lua o ka hana o na primers
ʻAʻole pono i nā primers ke hoʻohui i nā kaʻina hana, inā ʻaʻole e pelu nā primers iā lākou iho i loko o ka lauoho lauoho, a e pili ana kēia ʻano lua i ka hoʻopaʻa ʻana o nā primers a me nā templates ma muli o ka steric hindrance.Inā hoʻohana ʻia ka hoʻoholo ʻana, ʻaʻole pono e ʻoi aku ka nui o nā kumu hoʻohui mau o nā primers ma mua o 3bp.ʻAʻole pono ka hoʻohui ʻana ma waena o nā primers ʻelua, ʻoi aku ka nui o ka hoʻopili ʻana o ka hopena 3 'pono e pale ʻia e pale i ka hoʻokumu ʻana o nā dimer primer.Ma keʻano laulā, ʻaʻole pono e ʻoi aku ma mua o 4 mau kumu homology a i ʻole hoʻohui ʻia ma waena o nā kumu mua.
8. Hoʻohui i nā māka a i ʻole loci
He liʻiliʻi ka hopena o ka hopena 5 i ka kikoʻī amplification a no laila hiki ke hoʻololi ʻia me ka ʻole o ka hoʻopili ʻana i ka kikoʻī amplification.ʻO ka hoʻololi ʻana o ka primer 5 'hopena e komo pū ana: hoʻohui i kahi kahua kaohi enzyme;ʻO ka biotin i hoʻopaʻa inoa ʻia, fluorescence, digoxin, Eu3+, a pēlā aku.Hoʻokomo i nā kahua hoʻololi, hoʻokomo a nalowale nā kaʻina mutation a me ka hoʻokomo ʻana i nā kaʻina hoʻolaha, a me nā mea ʻē aʻe.Hiki ke hoʻohui ʻia nā kaʻina ʻē aʻe i loaʻa ʻole ma ke kaʻina pahuhopu, e like me nā kahua kaohi a me nā kaʻina hoʻolaha, hiki ke hoʻohui ʻia i ka hopena 5′ o ka primer me ka ʻole e pili ana i ka kikoʻī.ʻAʻole i hoʻokomo ʻia kēia mau kaʻina i ka helu ʻana i nā koina Tm kumu, akā pono e hoʻāʻo ʻia no ka hoʻohui ʻana a me ka hoʻolālā lua kūloko.
9. Nā subclones
ʻO ka hapa nui o ka manawa, ʻo ka PCR ka cloning mua wale nō, a laila pono mākou e hoʻokaʻawale i ka ʻāpana i hoʻopaʻa ʻia i loko o nā vectors like ʻole, no laila pono mākou e hoʻolālā i nā kumu hou no ka hana aʻe ma ka pae PCR.
ʻO kekahi mau kaʻina i hoʻolālā ʻia no ka subcloning i hōʻuluʻulu ʻia ma lalo nei.
Ua hoʻohui ʻia ka pae hoʻopaʻa endonuclease
ʻO ka hoʻohui ʻana i nā wahi hoʻopaʻa ʻana i ka enzyme ʻo ia ke ʻano hana maʻamau no ka subcloning i nā huahana PCR.'O ka ma'amau, he 'eono kumu o ka cleavage, me ka 5 'hopena o ka cleavage site e pono e ho'ohui i 2 ~ 3 mau kumu pale.Eia naʻe, ʻokoʻa ka helu o nā kumu pale e koi ʻia e nā enzyme like ʻole.No ka laʻana, ʻaʻole koi ʻo SalⅠ i kahi kumu pale, pono ʻo EcoRⅤ i 1 kumu pale, ʻAʻoleⅠ pono i 2 kumu pale, a ʻo Hind Ⅲ pono i 3 kumu pale.
Hoʻohui ʻo LIC i ka huelo
ʻO ka inoa piha o LIC ʻo Ligation-Independent cloning, kahi hana cloning i hana ʻia e Navogen kūikawā no kāna ʻāpana o ka vector pET.ʻO ka mea lawe pET i hoʻomākaukau ʻia e ke ʻano LIC, he 12-15 kumu hoʻokahi kaula i hoʻopaʻa ʻole ʻia, e hoʻokō i nā hopena pili pili i ka ʻāpana hoʻokomo.No ka hoʻonui ʻana, ʻo ke kaʻina mua 5′ o ka ʻāpana i hoʻokomo ʻia e hoʻokō pono i ka vector LIC.Hiki i ka hana ʻokoʻa 3′→5′ o T4 DNA polymerase ke hana i hoʻokahi kaula paʻa ma ka ʻāpana i hoʻokomo ʻia ma hope o ka manawa pōkole.No ka mea hiki ke hana ʻia ka huahana mai ka hoʻohui like ʻana o ka ʻāpana hoʻokomo i hoʻomākaukau ʻia a me ka vector, wikiwiki loa kēia ʻano a me ka maikaʻi, a ua kuhikuhi ʻia ʻo cloning.
Hoʻohui ʻia ʻo TA clone e hoʻohui i ka huelo
ʻAʻole hiki i ka TA cloning ke hoʻopaʻa i ka ʻāpana i loko o kahi vector, no laila ua hoʻokomo ʻo Invitrogen i kahi vector hiki ke hoʻopaʻa i ka cloning, aia i loko o ʻehā kumu koʻikoʻi GTGGS ma kekahi ʻaoʻao.No laila, i ka hoʻolālā ʻana i nā PCR primers, pono e hoʻohui ʻia nā kaʻina hoʻohui e like me ia, i hiki ke "oriented" nā ʻāpana.
Inā pōkole ʻoe i ka manawa, hiki iā ʻoe ke hoʻāʻo i ka synthesis pololei, e hoʻohui i ke ʻano me ka vector, ʻo ia ka mea a mākou e kapa ai ʻo ET gene synthesis i nā musecularists.
D. In-Fusion cloning ala
ʻAʻole koi ʻia ka ligase, ʻaʻohe hopena lōʻihi e pono ai.E like me ka lōʻihi o ke kaʻina ma nā ʻaoʻao ʻelua o ka vector linearized i hoʻokomo ʻia I ka hoʻolālā ʻana o nā primers, a laila hoʻohui ʻia ka huahana PCR a me ka vector linearized i loko o ka in-fusion enzyme solution i loaʻa i ka BSA a waiho ʻia ma ka lumi wela no ka hapalua hola, hiki ke hana i ka hoʻololi.He kūpono kēia ʻano no ka hoʻololi ʻana i ka leo nui.
10. Hui mua
I kekahi manawa, ʻike ʻia ka ʻike kaʻina liʻiliʻi e pili ana i ka hoʻolālā mua.No ka laʻana, inā ʻike ʻia ke kaʻina amino acid wale nō, hiki ke hoʻolālā ʻia ke kumu hoʻohui.ʻO ka primer merger kahi hui ʻana o nā kaʻina like ʻole e hōʻike ana i nā kumu kumu like ʻole a pau e hoʻopili ai i kahi waikawa amino hoʻokahi.No ka hoʻonui i ka kikoʻī, hiki iā ʻoe ke kuhikuhi i ka papa hoʻohana codon e hōʻemi i ka hoʻohui ʻana e like me nā makemake hoʻohana kumu o nā mea ola like ʻole.Hiki ke hoʻopili ʻia ka Hypoxanthine me nā kumu a pau e hoʻemi i ka mahana annealing o ka primer.Mai hoʻohana i nā kumu i hoʻohui ʻia ma ka hopena 3′ o ke kumu mua no ka mea ua lawa ka hoʻopili ʻana o nā kumu hope 3 ma ka hopena 3′ e hoʻomaka ai i ka PCR ma kahi pae hewa.Hoʻohana ʻia nā kumu kumu kiʻekiʻe (1μM a i 3μM) no ka mea, ʻaʻole kikoʻī nā primers i nā hui hoʻohui he nui i ke kumu hoʻohālike.
ʻO nā mea maka PCRhoʻomalu
1. Ka nui kumu
He 0.1 ~ 1umol a i ʻole 10 ~ 100pmol ka neʻe ʻana o kēlā me kēia primer.ʻOi aku ka maikaʻi o ka hana ʻana i ka hopena i makemake ʻia me ka haʻahaʻa haʻahaʻa o ka primer.ʻO ke kiʻekiʻe kiʻekiʻe o ka primer e hoʻoulu i ka mismatch a me ka hoʻonui ʻole ʻia, a hoʻonui i ka manawa e hana ai i nā dimer ma waena o nā primers.
2. ʻO ke kumu kumu
Hoʻopili ka manaʻo o nā primers i ka kikoʻī.ʻO ka manaʻo kumu mua loa ma waena o 0.1 a me 0.5μM.ʻO nā kumu kumu kiʻekiʻe e alakaʻi i ka hoʻonui ʻana i nā huahana nonspecific.
3. Anaaling wela o ka primer
ʻO kekahi mea koʻikoʻi no nā primers ka wela hoʻoheheʻe (Tm).ʻO kēia ka mahana ke hōʻike ʻia ka 50% o nā kumu mua a me nā kaʻina hoʻohui e like me nā molekole DNA kaulua.Pono ʻo Tm e hoʻonohonoho i ka mahana annealing PCR.ʻO ke kūpono, he haʻahaʻa haʻahaʻa ka mahana annealing e hōʻoia i ka hoʻopili pono ʻana o nā primers me ke kaʻina pahuhopu, akā lawa ka kiʻekiʻe e hōʻemi i ka hoʻopaʻa ʻole ʻana.ʻO ka mahana annealing kūpono mai 55 ℃ a 70 ℃.Hoʻonohonoho maʻamau ʻia ka mahana o Annealing 5 ℃ haʻahaʻa ma mua o Tm o ka primer.
Nui nā ʻano hoʻonohonoho no ka hoʻonohonoho ʻana i ka Tm, ʻokoʻa loa ia ma muli o ke ʻano i hoʻohana ʻia a me ke kaʻina o nā primers.No ka mea, hāʻawi ka hapa nui o nā formula i kahi waiwai Tm i manaʻo ʻia, he wahi hoʻomaka wale nō nā wela annealing āpau.Hiki ke hoʻomaikaʻi ʻia ka kikoʻī ma ke kālailai ʻana i kekahi mau hopena e hoʻokiʻekiʻe ana i ka mahana annealing.E hoʻomaka ma lalo o ka Tm-5 ℃ i manaʻo ʻia, a e hoʻonui mālie i ka mahana annealing ma kahi hoʻonui o 2 ℃.ʻO ka mahana annealing kiʻekiʻe e hōʻemi i ka hoʻokumu ʻana o nā dimer primer a me nā huahana kikoʻī ʻole.No nā hualoaʻa maikaʻi loa, pono e loaʻa i nā kumu mua ʻelua nā koina Tm.Inā ʻoi aku ka nui o ka ʻokoʻa Tm o nā hui mua ma mua o 5 ℃, e hōʻike ana nā kumu mua i kahi hoʻomaka hoʻopunipuni nui ma o ka hoʻohana ʻana i kahi mahana annealing haʻahaʻa i ka pōʻai.Inā ʻokoʻa nā kumu mua ʻelua Tm, e hoʻonoho i ka wela hoʻoheheʻe ʻana i 5 ℃ haʻahaʻa ma mua o ka Tm haʻahaʻa.ʻO kahi ʻē aʻe, no ka hoʻonui ʻana i ka kikoʻī, hiki ke hana mua i ʻelima mau pōʻai ma nā mahana annealing i hoʻolālā ʻia no ka Tm kiʻekiʻe, a ukali ʻia e nā pōʻai i koe i nā mahana annealing i hoʻolālā ʻia no Tm haʻahaʻa.Hiki i kēia ke kiʻi ʻia kahi kope ʻāpana o ke kumu hoʻohālike e hele ai ma lalo o nā kūlana paʻa.
4. Primer maemae a me ka paʻa
ʻO ka maʻemaʻe maʻamau o nā kumu mua maʻamau ua lawa no ka hapa nui o nā noi PCR.ʻO ka wehe ʻana i nā hui benzoyl a me isobutylyl ma ka desalting he mea liʻiliʻi a no laila ʻaʻole ia e hoʻopilikia i ka PCR.Pono kekahi mau noi e hoʻomaʻemaʻe e wehe i nā kaʻina holoʻokoʻa ʻole i ke kaʻina hana synthesis.Hana ʻia kēia mau ʻokiʻoki no ka mea ʻaʻole 100% ka maikaʻi o ka kemika synthesis DNA.He kaʻina hana pōʻai kēia e hoʻohana ana i nā hopena kemika i hoʻohui ʻia i kēlā me kēia kumu e hana i ka DNA mai 3' a i 5'.Hiki iā ʻoe ke hāʻule i kēlā me kēia pōʻai.ʻO nā kumu mua ʻoi aku ka lōʻihi, ʻoi aku ka nui ma mua o 50 mau kumu, he hapa nui o nā kaʻina oki ʻia a pono paha e hoʻomaʻemaʻe.
Hoʻopili ʻia ka hua o nā primers e ka maikaʻi o ke kemika synthetic a me ke ʻano hoʻomaʻemaʻe.ʻO nā hui biopharmaceutical, e like me Cytology a me Shengong, hoʻohana lākou i kahi ʻāpana OD liʻiliʻi e hōʻoia i ka huina o ka oligonucleoside.Hoʻouna ʻia nā kumu mua ma ke ʻano he pauda maloʻo.ʻOi aku ka maikaʻi o ka hoʻoheheʻe ʻana i nā primers ma TE no laila ʻo 100μM ka hopena hope loa.ʻOi aku ka maikaʻi o ka TE ma mua o ka wai deionized no ka mea he ʻakika pinepine ka pH o ka wai a e hoʻoulu i ka hydrolysis o nā oligonucleosides.
ʻO ke kūpaʻa o nā primers e pili ana i nā kūlana mālama.Pono e mālama ʻia ka pauka maloʻo a me nā primer i hoʻoheheʻe ʻia ma -20 ℃.Hiki ke mālama paʻa ʻia nā mea mua i hoʻoheheʻe ʻia ma TE ma ka nui ma mua o 10μM ma -20 ℃ no 6 mau mahina, akā hiki ke mālama ʻia ma ka lumi wela (15 ℃ a 30 ℃) no lalo o 1 pule.Hiki ke mālama ʻia nā primers pauka maloʻo ma -20 C no ka liʻiliʻi loa o 1 makahiki a ma ke ana wela (15 C a 30 C) a hiki i 2 mahina.
5. Nā Enzymes a me kā lākou hoʻopaʻa ʻana
I kēia manawa, ʻo ka Taq DNA polymerase i hoʻohana ʻia ʻo ia ka enzyme engineering gene i synthesed e coliform bacteria.ʻO ka nui o ka enzyme e pono ai no ka hoʻoulu ʻana i kahi hopena PCR maʻamau ma kahi o 2.5U (e pili ana i ka nui o ka hopena o 100ul).Inā kiʻekiʻe loa ka manaʻo, hiki ke alakaʻi i ka hoʻonui ʻole;inā haʻahaʻa loa ka manaʻo, e hoʻemi ʻia ka nui o ka huahana synthetic.
6. Ka maikaʻi a me ka noʻonoʻo o ka dNTP
ʻO ka maikaʻi o ka dNTP pili pili i ka ʻike a me ka pono o ka PCR amplification.ʻO ka pauka dNTP he granular, a nalowale kona ʻano like ʻole i kāna hana olaola inā mālama pono ʻia.ʻO kaʻaila dNTP he waikawa, a pono e hoʻohanaʻia i ke kiʻekiʻe kiʻekiʻe, me 1M NaOH a iʻole 1M Tris.HCL buffer solution e hoʻololi i kona PH i ka 7.0 ~ 7.5, ka liʻiliʻi o ka sub-packaging, ka mālama hau hau ma -20 ℃.E hoʻohaʻahaʻa i ka dNTP ka nui o ka hoʻoheheʻe ʻana.I ka hopena PCR, pono ka dNTP he 50 ~ 200umol/L.ʻO ka mea nui, pono e uku ʻia ka ʻike ʻana o nā DNTPS ʻehā (equal mole preparation).Inā ʻokoʻa ka noʻonoʻo ʻana o kekahi o lākou mai nā mea ʻē aʻe (kiʻekiʻe a haʻahaʻa paha), hiki ke hoʻohālikelike ʻia.ʻO ka haʻahaʻa haʻahaʻa e hōʻemi i ka hua o nā huahana PCR.Hiki i ka dNTP ke hui pū me Mg2+ a hoʻemi i ka manaʻo o ka Mg2+ manuahi.
7. Kikokikona (gene target) nucleic acid
ʻO ka nui a me ka hoʻomaʻemaʻe ʻana o ka template nucleic acid kekahi o nā loulou nui no ka holomua a i ʻole ka hemahema o PCR.Hoʻohana maʻamau nā ʻano hoʻomaʻemaʻe DNA kuʻuna i ka SDS a me ka protease K e ʻeli a hoʻolei i nā mea hoʻohālike.ʻO nā hana nui o SDS: e hoʻoheheʻe i nā lipids a me nā proteins ma ka membrane cell, pēlā e luku ai i ka membrane cell ma ka hoʻoheheʻe ʻana i nā protein membrane, a hoʻokaʻawale i nā protein nuklea i loko o ke kelepona, hiki i ka SDS ke hui pū me nā protein a me ka precipitate;Hiki i ka Protease K ke hydrolyze a e hoʻoheheʻe i nā protein, ʻoi aku ka nui o nā histones i hoʻopaʻa ʻia me DNA, a laila hoʻohana i ka phenol solvent organik a me ka chloroform e unuhi i nā protein a me nā ʻāpana cell ʻē aʻe, a hoʻohana i ka ethanol a i ʻole isopropyl alcohol e hoʻoheheʻe i ka waikawa nucleic.Hiki ke hoʻohana ʻia ka ʻakika nucleic i unuhi ʻia ma ke ʻano he kumu hoʻohālike no nā hopena PCR.No nā hiʻohiʻona ʻike lapaʻau maʻamau, hiki ke hoʻohana ʻia ke ʻano wikiwiki a maʻalahi e hoʻoheheʻe i nā cell, lysate pathogens, digest a hoʻoneʻe i nā protein mai nā chromosomes e hoʻokuʻu i nā genes target, a hoʻohana pololei ʻia no ka PCR amplification.Hoʻohana maʻamau ka unuhi ʻana i ka template RNA i ke ʻano guanidine isothiocyanate a i ʻole protease K no ka pale ʻana iā RNase mai ka hoʻohaʻahaʻa ʻana i ka RNA.
8.Mg2+ hoʻopaʻa
He hopena koʻikoʻi ka Mg2+ i ka kikoʻī a me ka hua o ka PCR amplification.ʻO ka hopena PCR maʻamau, inā he 200umol/L ka nui o nā dNTP like ʻole, ʻo ka ʻike kūpono o Mg2+ ʻo 1.5 ~ 2.0mmol/L.ʻOi aku ka kiʻekiʻe o ka Mg2+, hoʻemi ka kikoʻī o ka hopena, hiki ke hoʻonui ʻole ʻia, ʻoi aku ka haʻahaʻa haʻahaʻa e hōʻemi i ka hana o Taq DNA polymerase, ka hopena i ka hōʻemi ʻana o nā huahana hopena.
Hoʻopili nā ion Magnesium i kekahi mau mea o ka PCR, e like me ka hana DNA polymerase, e pili ana i ka hua;ʻO kekahi laʻana ʻo ka primer annealing, e pili ana i ka kikoʻī.Hoʻopili ʻia ka dNTP a me ka template i ka magnesium ion, e hōʻemi ana i ka nui o ka magnesium manuahi e pono ai no ka hana enzyme.ʻOkoʻa ka ʻike ʻana o ka magnesium ion no nā pālua a me nā mamana like ʻole, akā ʻo ka PCR maʻamau e hoʻomaka ana me ka 200μM dNTP ʻo 1.5mM (nota: No ka PCR quantitative manawa maoli, e hoʻohana i ka solution 3 a 5mM magnesium ion solution me kahi ʻimi fluorescent).Hoʻonui ka hoʻonui ʻana o nā iona magnesium manuahi i ka hua, akā hoʻonui pū i ka hoʻonui nonspecific a hoʻemi i ka hilinaʻi.No ka hoʻoholo ʻana i ka manaʻo maikaʻi loa, ua hana ʻia nā titrations ion magnesium ma nā hoʻonui o 0.5mM mai 1mM a i 3mM.No ka ho'ēmiʻana i ka hilinaʻi i ka magnesium ion optimization, hiki ke hoʻohana ʻia ka Platinum Taq DNA polymerase.Hiki i ka Platinum Taq DNA polymerase ke hoʻomau i ka hana ma luna o kahi ākea o ka magnesium ion concentrations ma mua o Taq DNA polymerase a no laila pono ka liʻiliʻi o ka optimization.
9. Pcr-promoting additives
ʻO ka hoʻonui ʻia ʻana o ka mahana annealing, ka hoʻolālā mua, a me ka hoʻopaʻa ʻana o ka magnesium ion ua lawa no ka hoʻonui kikoʻī ʻana o ka hapa nui o nā template;akā naʻe, pono kekahi mau laʻana, me nā mea me ka GC kiʻekiʻe, i nā ana hou.ʻO nā mea hoʻohui e pili ana i ka wela hoʻoheheʻe o DNA e hāʻawi i kahi ala ʻē aʻe e hoʻomaikaʻi ai i ka kikoʻī a me ka hua.Pono ka denaturation piha o ka template no nā hopena maikaʻi loa.
Eia kekahi, ke pale nei ka papa hana lua i ka hoʻopaʻa mua ʻana a me ka hoʻonui ʻana i ka enzyme.
ʻO nā mea hoʻohui PCR, me ka formamide, DMSO, glycerin, betaine, a me PCRx Enhancer Solution, hoʻonui i ka amplification.ʻO kā lākou hana hiki ke hoʻemi i ka wela hoʻoheheʻe ʻana, no laila e kōkua ana i ka annealing o nā primers a me ke kōkua ʻana i ka hoʻonui ʻia ʻana o DNA polymerase ma o ka ʻāpana kūkulu lua.He mau pono ʻē aʻe ka PCRx Solution.Pono ka liʻiliʻi o ka magnesium ion optimization ke hoʻohana ʻia me Platinum Taq DNA polymerase a me Platinum Pfx DNA polymerase.No laila, ua hui pū ʻia ka ʻenehana Platinum me ka additive e hoʻonui i ka kikoʻī ʻoiai e hōʻemi ana i ka hilinaʻi o ke kolu o ke ala, ka magnesium ion optimization.No nā hualoaʻa maikaʻi loa, pono e hoʻonui ʻia ka neʻe ʻana o nā mea hoʻohui, ʻoi aku ka DMSO, formamide, a me ka glycerol, ka mea e pale ai i ka Taq DNA polymerase.
10. Hoomaka wela
ʻO ka PCR hoʻomaka wela kekahi o nā ala koʻikoʻi e hoʻomaikaʻi ai i ka kikoʻī PCR ma kahi o ka hoʻolālā kumu maikaʻi.ʻOiai ʻo ka mahana elongation maikaʻi loa o Taq DNA polymerase he 72 ℃, e hoʻomau mau ana ka polymerase i ka wela lumi.No laila, hana ʻia nā huahana kikoʻī ʻole i ka wā e haʻahaʻa ai ka mahana paʻa ma mua o ka mahana annealing i ka wā o ka hoʻomākaukau ʻana i ka hopena PCR a i ka hoʻomaka ʻana o ka pōʻai wela.Ke hana ʻia, hoʻonui maikaʻi ʻia kēia mau huahana nonspecific.ʻOi aku ka maikaʻi o ka PCR hoʻomaka wela ke kaupalena ʻia nā wahi i hoʻohana ʻia no ka hoʻolālā mua ʻana e ka wahi o nā mea genetic, e like me ka hoʻololi ʻana i ka pae, ka cloning hōʻike, a i ʻole ke kūkulu ʻana a me ka hoʻoponopono ʻana i nā mea genetic i hoʻohana ʻia no ka ʻenekinia DNA.
ʻO ke ala maʻamau e kaupalena ai i ka hana o Taq DNA polymerase, ʻo ia ka hoʻomākaukau ʻana i ka hopena hopena PCR ma ka hau a waiho ʻia i loko o kahi mea PCR preheated.He maʻalahi a maʻalahi kēia ʻano, akā ʻaʻole ia e hoʻopau i ka hana o ka enzyme a no laila ʻaʻole ia e hoʻopau loa i ka hoʻonui ʻana o nā huahana kikoʻī ʻole.
Hoʻopaneʻe ka thermal priming i ka synthesis DNA ma ke kāohi ʻana i kahi mea koʻikoʻi a hiki i ka PCR mea hana i ka mahana denaturation.ʻO ka hapa nui o nā ʻano hana hoʻomaka wela, me ka hoʻohui ʻana o Taq DNA polymerase, he paʻakikī, ʻoi aku ka nui o nā noi kiʻekiʻe.Hoʻohana nā ʻano hana hoʻomaʻamaʻa wela ʻē aʻe i ka pale wax e hoʻopaʻa i kahi mea pono, me nā ion magnesium a i ʻole nā enzymes, a i ʻole e hoʻokaʻawale kino i nā ʻāpana reactive, e like me nā templates a me nā pale.I ka wā o ka pōʻai wela, hoʻokuʻu ʻia nā ʻāpana like ʻole a hui pū ʻia me ka heheʻe ʻana o ka wax.E like me ke ʻano hoʻomaka wela manual, paʻakikī ke ʻano o ka pale wax a hiki ke hoʻohaumia ʻia a ʻaʻole kūpono no nā noi kiʻekiʻe.
He mea maʻalahi ka Platinum DNA polymerase no ka PCR hoʻomaka wela.ʻO ka Platinum Taq DNA polymerase ka recombinant Taq DNA polymerase i hui pū ʻia me ka monoclonal antibody e kūʻē iā Taq DNA polymerase.Hoʻokumu ʻia nā antibodies e PCR e kāohi i ka hana enzyme i ka wā lōʻihi o ka paʻa ʻana i ka mahana.Ua hoʻokuʻu ʻia ʻo Taq DNA polymerase i ka hopena i ka wā o ka insulation 94 ℃ o ka pae denaturation, e hoʻihoʻi i ka hana polymerase piha.He ʻokoʻa i ka Taq DNA polymerase i hoʻololi ʻia no ka hoʻomaka ʻana o ka wela, ʻaʻole koi ʻo Platinum enzyme i ka insulation lōʻihi ma 94 ℃ (10 a 15 mau minuke) e hoʻāla ai i ka polymerase.Me PlatinumTaq DNA polymerase, 90% o Taq DNA polymerase hana i hoʻihoʻi ʻia ma hope o 2 mau minuke ma 94 ℃.
11. Pūnana-PCR
Hiki ke hoʻomaikaʻi i ka kikoʻī a me ka noʻonoʻo ʻana i nā pōʻai holomua o ka amplification me ka hoʻohana ʻana i nā kumu mua.ʻO ka pōʻai mua he hoʻonui maʻamau o 15 a 20 mau pōʻai.Ua hoʻoheheʻe ʻia kahi hapa liʻiliʻi o ka huahana amplification mua 100 a 1000 mau manawa a hoʻohui ʻia i ka pōʻai lua o ka hoʻonui ʻana no 15 a 20 mau pōʻai.ʻO kahi ʻē aʻe, hiki ke hoʻonui ʻia ka huahana hoʻonui mua e ka hoʻomaʻemaʻe gel.Hoʻohana ʻia kahi kumu mua i ka pōʻai ʻelua o ka hoʻonui ʻana, hiki ke hoʻopaʻa i ke kaʻina pahuhopu i loko o ka primer mua.ʻO ka hoʻohana ʻana i ka PCR pūnana e hōʻemi ana i ka hiki ke hoʻonui ʻia o nā pūnaewele i hoʻopaʻa ʻia no ka mea he liʻiliʻi nā kaʻina pahuhopu e hoʻokō i nā pūʻulu kumu ʻelua.ʻO ka huina like o nā pōʻaiapuni (30 a 40) me nā kumu mua i hoʻonui i nā wahi kikoʻī ʻole.Hoʻonui ka nested PCR i ka naʻau o nā kaʻina i hoʻopaʻa ʻia (e laʻa, nā mrnas kakaʻikahi) a hoʻomaikaʻi i ka kikoʻī o nā PCRS paʻakikī (e laʻa me 5′ RACE).
12. Ke iho nei PCR
ʻO ka iho ʻana o ka PCR e hoʻomaikaʻi i ka kikoʻī ma o ka hoʻohana ʻana i nā kūlana annealing paʻa no nā pōʻai mua o PCR.Hoʻomaka ka pōʻaiapuni ma kahi mahana annealing ma kahi o 5 ℃ kiʻekiʻe ma mua o ka Tm i manaʻo ʻia, a laila hoʻemi ʻia kēlā me kēia pōʻaiapili e 1 ℃ a 2 ℃ a hiki i ka mahana annealing ma lalo o Tm 5 ℃.E hoʻonui ʻia ke kumu hoʻohālike me ka homology kiʻekiʻe loa.Ke hoʻomau nei kēia mau huahana i ka hoʻonui ʻana i nā pōʻai ma hope, e hoʻonui ana i nā huahana nonspecific amplified.Pono ka iho ʻana o ka PCR no nā ʻano i ʻike ʻole ʻia ke degere o ka homology ma waena o ke kumu mua a me ka hoʻohālikelike ʻana, e like me ka AFLP DNA fingerprinting.
Nā Kime PCR pili
ʻO ka 2 × PCR HeroTMʻOi aku ka ʻoi aku o ka hoʻomanawanui ʻana o ka ʻōnaehana hui i nā mea hoʻopaneʻe PCR ma mua o ka ʻōnaehana PCR Mix maʻamau, a hiki ke maʻalahi i ka hoʻonui ʻana i ka PCR o nā ʻano paʻakikī like ʻole.ʻO ka ʻōnaehana hoʻololi kū hoʻokahi a me ka Taq Hero kiʻekiʻe e hana i ka hopena PCR i ʻoi aku ka kiʻekiʻe o ka amplification pono, kikoʻī a me ka naʻau.
ʻOi aku ka maikaʻi o ka hoʻonui ʻana
Loaʻa iā 5'→3' DNA polymerase hana a me 5'→3' exonuclease hana, me ka 3'→5' hana exonuclease.
ʻO ka PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Hiki ke pale i ka hoʻonui ʻole kikoʻī a me ka hoʻokumu ʻana o ka dimer maʻamau.
Hiki ke ʻike i nā kope haʻahaʻa o ka laʻana
RT-PCR Easyᵀᴹ I(Hoʻokahi Kaʻina)
Ke hoʻohana nei ka pahu i kahi mea hoʻohālikelike Foregene reverse transcription reagent a me Foregene HotStar Taq DNA Polymerase i hui pū ʻia me kahi ʻōnaehana kū hoʻokahi e hoʻomaikaʻi maikaʻi i ka pono amplification a me ka kikoʻī o ka pane.
Ka manawa hoʻouna: Mei-09-2023
