ʻO Fluorescence quantitative PCR (ʻike pū ʻia ʻo TaqMan PCR, i kapa ʻia ʻo FQ-PCR) he ʻenehana hou nucleic acid quantitative i hoʻomohala ʻia e PE (Perkin Elmer) ma ʻAmelika Hui Pū ʻIa i ka makahiki 1995. Hoʻokumu ʻia kēia ʻenehana i ka PCR maʻamau ma o ka hoʻohui ʻana i nā probes lepili fluorescent.Hoʻohālikelike ʻia me ka PCR maʻalahi, FQ-PCR he nui nā pono e ʻike ai i kāna hana quantitative.Manaʻo kēia ʻatikala e wehewehe pōkole i nā ʻano, nā loina, nā ʻano, a me nā hoʻohana ʻana o ka ʻenehana.
1 Nā hiʻohiʻona
ʻAʻole wale ʻo FQ-PCR i ka ʻike kiʻekiʻe o ka PCR maʻamau, akā no ka hoʻohana ʻana i nā probes fluorescent, hiki iā ia ke ʻike pololei i ka hoʻololi ʻana o ka hōʻailona fluorescent i ka hoʻonui ʻana o PCR ma o ka ʻōnaehana photoelectric conduction e loaʻa ai nā hopena quantitative, e lanakila ana i nā hemahema he nui o ka PCR maʻamau, no laila, loaʻa iā ia ke kikoʻī kiʻekiʻe o ka ʻenehana DNAcycycycytes a me ka spectroscopy kiʻekiʻe.
No ka laʻana, pono e nānā ʻia nā huahana PCR maʻamau e ka electrophoresis gel agarose a me ka hoʻopaʻa ʻana i ka ethidium bromide me ke kukui ultraviolet a i ʻole e ka polyacrylamide gel electrophoresis a me ke kala kala.ʻAʻole pono kēia i nā mea kani he nui, akā pono pū ka manawa a me ka hoʻoikaika.ʻO nā stains i hoʻohana ʻia ʻo Ethidium bromide he mea pōʻino i ke kino o ke kanaka, a ʻo kēia mau kaʻina hana hoʻokolohua paʻakikī e hāʻawi i nā manawa no ka haumia a me nā hopena hoʻopunipuni.Eia naʻe, FQ-PCR wale nō pono e wehe i ke poʻi i hoʻokahi manawa i ka hoʻouka ʻana o ka laʻana, a ʻo ke kaʻina hana ma hope ua paʻa loa ka hana ʻana, ʻaʻole pono ka PCR post-processing, e pale ana i nā drawbacks i nā hana PCR maʻamau.Hoʻohana maʻamau ka hoʻokolohua i ka ABI7100 PCR thermal cycler i hoʻomohala ʻia e ka hui PE.
Loaʻa i ka mea hana nā hiʻohiʻona penei: ① Ke noi ākea: Hiki ke hoʻohana ʻia no ka helu DNA a me RNA PCR huahana, noiʻi hōʻike gene, ʻike pathogen, a me ka optimization o nā kūlana PCR.② Kuʻuna helu kūʻokoʻa: Me ka hoʻohana ʻana i nā probes fluorescently labeled, e hōʻiliʻili ka nui o ka fluorescence me ka PCR cycle ma hope o ka hoʻoulu ʻana i ka laser, i mea e hoʻokō ai i ke kumu o ka quantification.③ ʻO ka maikaʻi hana kiʻekiʻe: ʻO 9600 PCR thermal cycler, mālama ʻia ka kamepiula i 1 a 2 mau hola e hoʻopau i ka hoʻonui a me ka helu ʻana o nā laʻana 96 me ka maʻalahi a me ka synchronously.④ ʻAʻohe pono o ka electrophoresis gel: ʻAʻole pono e hoʻoheheʻe a electrophoresis i ka laʻana, e hoʻohana wale i kahi ʻimi kūikawā e ʻike pololei i ka paipu hopena.⑤ʻAʻohe haumia i loko o ka pipeline: Ua hoʻohana ʻia ka ʻōnaehana hoʻopihapiha piha piha a me ka ʻōnaehana hoʻoiho photoelectric, no laila ʻaʻohe pono e hopohopo e pili ana i ka pollution.⑥ Hiki ke hoʻopuka hou ʻia nā hopena: ʻo ka nui o ka dynamic range a hiki i ʻelima mau kauoha o ka nui.No laila, ʻoiai ua hoʻomohala maikaʻi ʻia kēia ʻenehana, ua waiwai nui ia e nā mea noiʻi ʻepekema he nui a ua hoʻohana ʻia ma nā ʻano he nui.
2 Nā loina a me nā ʻano hana
ʻO ka loina hana o FQ-PCR, ʻo ia ka hoʻohana ʻana i ka hana exonuclease 5′→3′ o Taq enzyme e hoʻohui i kahi noiʻi fluorescently lepili i ka ʻōnaehana pane PCR.Hiki i ka probe ke hoʻohui like me ka DNA template i loko o ke kaʻina kumu.Hoʻopaʻa inoa ʻia ka 5′end o ka probe me ka fluorescence emission gene FAM (6-carboxyfluorescein, fluorescence emission peak ma 518nm), a ua kapa ʻia ka 3′end me The fluorescence quenching group TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, fluorescence emission peak ma ka 582 emission peak ma ka 582 emission peak ma ka 582 emission peak ma ka 582 emission peak ma 582 mai ka hoʻonui ʻia ʻana o ka probe i ka wā PCR amplification.Ke hoʻomau mau ka ʻimi noiʻi, hoʻopaʻa ka pūʻulu kinai i ka hoʻokuʻu fluorescence o ka hui hoʻokuʻu.Ke hoʻokaʻawale ʻia ka pūʻulu emitting mai ka hui quenching, hoʻokiʻekiʻe ʻia ka inhibition, a piʻi ka optical density ma 518nm a ʻike ʻia e ka ʻōnaehana ʻike fluorescence.Ke ʻoki ʻia ka ʻimi noiʻi, hoʻokuʻu ʻia ka hopena quenching a hoʻokuʻu ʻia ka hōʻailona fluorescent.I kēlā me kēia manawa ke kope ʻia ka laʻana, ʻoki ʻia kahi ʻimi noiʻi, me ka hoʻokuʻu ʻana i kahi hōʻailona fluorescent.No ka mea aia ka pilina hoʻokahi ma waena o ka helu o nā fluorophores i hoʻokuʻu ʻia a me ka helu o nā huahana PCR, hiki ke hoʻohana ʻia kēia ʻenehana no ka helu pono ʻana i ke ʻano.Hoʻohana maʻamau ka mea hoʻokolohua i ka ABI7100 PCR thermal cycler i hoʻomohala ʻia e ka hui PE, a hiki ke hoʻohana ʻia nā mea hoʻokele wela ʻē aʻe.Inā hoʻohana ʻia ka ʻōnaehana pane ʻano ʻano ABI7700 no ka hoʻokolohua, ma hope o ka pau ʻana o ka hopena, hiki ke hāʻawi pololei ʻia nā hopena quantitative ma o ka loiloi kamepiula.Inā hoʻohana ʻoe i nā mea hoʻokele wela ʻē aʻe, pono ʻoe e hoʻohana i ka mea ʻike fluorescence e ana i ka hōʻailona fluorescence i loko o ka paipu hopena i ka manawa like e helu ai i ka RQ+, RQ-, △RQ.Hōʻike ʻo RQ+ i ka lakio o ka nui o ka luminescence o ka hui hoʻoheheʻe fluorescent o ka pahu hāpana i ka ikaika o ka luminescence o ka hui kinai, RQ- hōʻike i ka lakio o nā mea ʻelua i loko o ka pahu hakahaka, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) e hōʻike ana i ka nui o ka hoʻololi ʻana o ka hōʻailona fluorescence i ka wā PCR Ma hope o ka hoʻoili ʻana o ka ʻikepili hiki ke quanti.Ma muli o ka hoʻokomo ʻana o nā ʻimi fluorescent, ua hoʻomaikaʻi nui ʻia ka kikoʻī o ka hoʻokolohua.Pono ka hoʻolālā probe e hoʻokō i kēia mau kūlana: ①ʻO ka lōʻihi o ka probe ma kahi o 20-40 kumu e hōʻoia ai i ka kikoʻī o ka paʻa.② Aia ma waena o 40% a me 60% ka maʻiʻo o nā kumu GC no ka pale ʻana i ka hana hou ʻana o nā kaʻina nucleotide hoʻokahi.③ Hōʻalo i ka hoʻohuihui ʻana a i ʻole ka uhi ʻana me nā kumu mua.④ ʻOi aku ka paʻa o ka hoʻopaʻa ʻana ma waena o ka probe a me ka template ma mua o ka paʻa o ka hoʻopaʻa ʻana ma waena o ke kumu mua a me ka template, no laila ʻo ka waiwai Tm o ka probe ma kahi o 5 ° C kiʻekiʻe ma mua o ka waiwai Tm o ke kumu.Eia kekahi, ʻo ka hoʻopaʻa ʻana o ka probe, ka homology ma waena o ka probe a me ke kaʻina template, a me ka mamao ma waena o ka probe a me ka primer i nā hopena hoʻokolohua.
Nā huahana pili:
Kina Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Mea Hana a me ka mea hoʻolako |Foregene (foreivd.com)
Ka manawa hoʻouna: Oct-15-2021
