ʻO RT-qPCR ka hoʻokolohua maʻamau o ka biology molecular, a pono nā mea a pau e kamaʻāina me ia.Loaʻa iā ia ʻekolu mau ʻanuʻu: RNA extraction, reverse transcription into cDNA, a me ka PCR fluorescent quantitative manawa maoli.ʻAʻole kōkua, he aha ka hana?He pilikia paha meka hoʻokolohua hoʻololi hoʻololi!ʻOiai me he mea lā ʻo ka hoʻokolohua transcription hoʻohuli wale nō e pono e hoʻohui i RNA, dNTP, primers, a metranscriptase hoʻohulii ka centrifuge paipu a hui maikaʻi, akā, i loko o ka hana maoli kaʻina hana, aia nō he nui nā kiko'ī e pono e uku i ka noonoo.E aʻo kākou no ia mea!

Pehea e hoʻoholo ai i ka maikaʻi o ka RNA?
No ka loaʻa ʻana o ka cDNA, koʻikoʻi ka maikaʻi o ka RNA!Hiki ke ʻike ʻia ka maikaʻi o ka RNA mai nā ʻano ʻelua:
(1) RNA pono:Hiki ke hōʻoia i ka pono RNA e ka electrophoresis gel agarose. I ka lawe ʻana i nā eukaryotes ma ke ʻano he laʻana, ʻo ka huina holoʻokoʻa o ka RNA he ʻekolu mau kaha māmā, ʻo nā paona molekala mai ka nui a hiki i ka liʻiliʻi ʻo 28S, 18S, a me 5S, a ʻo 28S ʻelua ʻoi aku ka māmā o ka 18S;inā hiki ke ʻike ʻia ʻekolu mau pūʻali, akā pōwehiwehi ke ʻano o ka band a i ʻole Diffusion ʻo ia hoʻi, ua hoʻohaʻahaʻa ʻia ka RNA.I kēia manawa, e ʻoluʻolu e hoʻokō koke i ka hoʻihoʻi ʻana i ka unuhi ʻana a hoʻonui i ka hoʻokomo ʻana ma ke kūpono;inā hiki ke ʻike ʻia kahi puʻupuʻu liʻiliʻi liʻiliʻi a ʻaʻole paha i ʻike ʻia, ua hoʻohaʻahaʻa ʻia ka RNA a pono e unuhi hou ʻia.Hōʻike ʻo Agilent 2100 i ka pono o ka RNA me ke kiʻi kiʻekiʻe a me ka waiwai RIN.Inā paʻa ka ʻakika nucleic, palahalaha ke kumu o ka electropherogram;inā hoʻohaʻahaʻa nui ʻia ka waika nucleic, ʻaʻole kaulike ke kumu a ʻoi aku ka nui o nā piko hoʻohaʻahaʻa;hōʻike ka waiwai o RIN i ka pono o ka RNA, i loko o ka laulā o 0-10, ʻoi aku ka nui o ka waiwai, ʻoi aku ka maikaʻi o ka RNA.ʻAe, ʻoi aku ka kiʻekiʻe o ka hoʻopiha piha.
(2) Maʻemaʻe o RNA:Hiki ke ʻike ʻia ka lakio o OD260/280 e UV spectrophotometry.Inā aia ka lakio o OD260/280 ma waena o 1.9 a me 2.1, maikaʻi loa ka maʻemaʻe.
Hiki i ke koena genomic DNA ke alakaʻi i nā hopena quantitative pololei ʻole
Ke unuhi ʻia ka RNA, hiki ke hui ʻia ka RNA i loaʻa iā mākou me ka genomic DNA (gDNA) ʻaʻole i hoʻomaʻemaʻe ʻia.No laila, e hui pū ʻia ka cDNA ma hope o ka unuhi ʻanagDNA.I ka wā o laloqPCRpane,cDNAa hiki ke hoʻonui ʻia ka gDNA i ka manawa hoʻokahi, e hopena i kahi waiwai CT liʻiliʻi, no laila hiki ke hoʻohālikelike ʻia nā hopena.
No laila he aha kā mākou e hana ai i kēia kūlana?Foregenemanaʻo:
(1) Hana i ka hoʻomaʻemaʻe genome ma ka RNA i hoʻohuli ʻia, hiki ke hoʻoneʻe ʻia e ke kolamu i ka wā o ka unuhi ʻana o RNA;
(2) E mālama i ka RNA i unuhi ʻia me DNaseI , akā e hoʻopau iā ia me EDTA;
o na reagents transcription hoohulime nā modula hoʻomaʻemaʻe genome;

Pehea e koho ai i nā primers no ka transcription reverse?
Hoʻopili pū ʻia nā kumu mua transcription i ka hopena o ka hopena o ka unuhi ʻana.Hiki iā ʻoe ke koho i nā kumu mua ʻole, Oligo dT a i ʻole nā ​​gene-specific primers no ka hoʻohuli hou ʻana e like me nā kūlana kikoʻī o ka hoʻokolohua:
(1) Nā palapala kikoʻī: ʻōlelo ʻia nā kumu mua o nā gene;
(2) Nā ʻāpana ʻāpana lōʻihi: Oligo dT/gene-specific primers ua paipai ʻia;
(3) Nā ʻāpana kūloko o nā moʻolelo ʻāpana lōʻihi: nā mea hoʻomaka kikoʻī kikoʻī kikoʻī/genes-specific primers / nā kumu mua ʻole + Oligo dT.Inā hoʻokō ʻia ka hoʻokolohua qPCR ma hope, ʻaʻole hiki ke hoʻohana wale ʻia ʻo Oligo dT, no ka mea, ʻo ka hoʻohana ʻana iā Oligo dT wale nō ke kumu o ka 3′ end bias, e alakaʻi ana i nā hopena hoʻokolohua qPCR pololei ʻole;
(4) miRNA: Hiki ke hoʻohana ʻia nā kumu kumu-loop primer a i ʻole nā ​​kumu huelo.

ʻEhia mau manawa e hoʻoheheʻe ʻia ka cDNA huahana unuhi hou no ka helu ʻana?
Ma hope o ka loaʻa ʻana o ka cDNA o ka huahana transcription hope, ehia mau manawa e hoʻoheheʻe ʻia ka cDNA no nā hoʻokolohua qPCR he mea nui loa.Inā kiʻekiʻe a haʻahaʻa paha ka manaʻo cDNA, hiki ke hoʻopili ʻia ka hana hoʻonui.Hiki ke ana ʻia ka ʻike cDNA, a pehea e hana ʻia ai?
(1) ʻAʻole hiki ke ana ʻia ke ʻano o ka cDNA o ka huahana transcription reverse, no ka mea, ma waho aʻe o ka huahana cDNA, aia pū ka huahana transcription reverse Buffer, reverse transcriptase, primers, a me nā mea ʻē aʻe, ka mea e hoʻopilikia ai i nā hopena ana ʻana a kumu o OD260/280, OD260/230.I keia wa, e olelo mai kekahi mau hoa, alaila, ana au i ka noonoo ana mahope o ka hoomaemae ana;maʻaneʻi, makemake ʻo Foregene e hoʻomanaʻo ʻaʻole ʻōlelo ʻia ka cDNA e hoʻomaʻemaʻe, no ka mea, ʻokoʻa ka lōʻihi o ka cDNA i loaʻa ma ka hoʻohuli ʻana, a e nalowale ka cDNA pōkole i ka hoʻomaʻemaʻe.
(2) No laila he aha ka hana?Ma mua o ka hoʻokolohua qPCR, hiki ke hoʻoholo ʻia ka dilution gradient o ka cDNA ma o ka hoʻokolohua mua.No ka laʻana: e hoʻohana i ka solution stock cDNA, 10-fold dilution, a me 100-fold dilution ma ke ʻano he laʻana no nā hoʻokolohua qPCR, a koho i ka mea hoʻoheheʻe me kahi waiwai CT ma ka laulā o 18-28.

Pehea e hoʻohuli ʻia ai nā miRNA?
ʻO ka miRNA kahi mole liʻiliʻi liʻiliʻi RNA me ka nui ma kahi o 22 nt ʻaʻole i hoʻopaʻa inoa no ka protein.Ma muli o kona lōʻihi pōkole, paʻakikī ke ʻano qPCR maʻamau e helu pololei iā ia, no laila pono pinepine e hoʻonui i ka miRNA;ʻO nā ʻano unuhi hoʻohuli maʻamau i hoʻohana ʻia no ka miRNA, ʻo ia ke ʻano kumu-loop a me ke ʻano huelo.
ʻO ke ʻano kumu-loop ka hoʻonui ʻana i ka miRNA ma ka hoʻohui ʻana i nā kumu kumu-loop.ʻOi aku ka kiʻekiʻe o kēia ʻano ʻike ʻike a me ka kikoʻī, akā haʻahaʻa ka throughput ʻike.Hiki ke ʻike i hoʻokahi transcription hoʻohuli i hoʻokahi miRNA a me kahi kuhikuhi kūloko;ʻO ke ʻano o ka hoʻohui ʻana i ka huelo he ʻelua.ʻO PolyA polymerase ke kuleana no ka hoʻohui ʻana i nā huelo PolyA i ka miRNA e hoʻonui i kona lōʻihi, a ʻo ka reverse transcriptase e hana i ka hopena transcription reverse.He kiʻekiʻe ka ʻike ʻana o kēia ʻano a hiki ke ʻike i nā miRNA he nui a me nā kuhikuhi kūloko i hoʻokahi transcription hoʻohuli, akā haʻahaʻa ka naʻau a me ka kikoʻī i ke ʻano stem-loop.