kikoo o ka ike
I ka hapanui o nā hihia, ʻo ke kumu o ka hoʻolālā mua e hoʻonui i ka kikoʻī o PCR.Hoʻoholo ʻia kēia e ka ʻoi aku a i ʻole ka liʻiliʻi o ka manaʻo o nā ʻano like ʻole.ʻO kekahi hoʻololi koʻikoʻi ʻo ia ke kaʻina ma ka 3′hopena o ka primer.
ʻO ka mea nui, ʻoi aku ka maikaʻi o ka PCR assays i hoʻolālā ʻia no ka kikoʻī e mālama i ka hana kiʻekiʻe ma kahi ākea ākea, no ka mea, ʻaʻole hana ka assay i nā huahana amplification non-specific, no laila ke hoʻokūkū nei me nā PCR reagents a i ʻole ke kāohi ʻana i ka hopena amplification nui.
ʻOiaʻiʻo, i kekahi mau hihia, ʻaʻole ka mea nui ka kikoʻī, no ka laʻana, ʻo ka pahuhopu ka helu ʻana i ka pili pili akā nā pathogens like ʻole, ka hoʻolālā kūikawā, optimization a me nā kūlana hōʻoia.
He ʻano maʻamau ka hoʻoheheʻe ʻana no ka loiloi ʻana i ke ʻano kikoʻī o nā amplicons, ma ka liʻiliʻi loa e pili ana i ka hoʻonui ʻana i kahi pahuhopu hoʻokahi.Eia naʻe, pono e hoʻokūpaʻa ʻia he hiki ke alakaʻi hewa nā ʻāpana hoʻoheheʻe ʻana no ka mea, no ka laʻana, hiki ke hoʻopili ʻia e nā hopena i hui pū ʻia o nā suboptimal primers a me nā kumu haʻahaʻa haʻahaʻa.
P5 |Hōʻike ka pōʻai hoʻoheheʻe i nā hoʻololi Tm i loaʻa mai nā ʻike ʻelua o nā helu like ʻole o ʻelua mau DNA pahuhopu.
A. Ma nā haʻahaʻa kiʻekiʻe (ad)), ʻaʻohe dimer kumu mua ma hope o ka pau ʻana o ke ana qPCR.I ka emi ʻana o ka manaʻo hoʻohālike i 50 kope (e), hoʻomaka ka ʻike ʻana o kahi huahana kikoʻī ʻole a lilo i huahana hoʻokahi ma ka haʻahaʻa haʻahaʻa (f).
B. Ua hoʻopaʻa ʻia ka hoʻāʻo ʻana i nā Tms hoʻokahi ma nā koina i manaʻo ʻia, a ʻaʻohe dimer kumu mua i ʻike ʻia ma ka ʻike haʻahaʻa loa (5 kope).I ka hoʻohana ʻana i kēia mau ʻano ʻike ʻelua, ʻaʻohe huahana amplification i ʻike ʻia ma nā NTC.
Hōʻike ka P5 i nā ʻāpana hoʻoheheʻe i loaʻa me nā laʻana kahi i loaʻa ai ka laʻana ma nā ʻano ʻokoʻa.Hōʻike ka P 5a ma nā haʻahaʻa haʻahaʻa ʻelua, ʻoi aku ka haʻahaʻa o nā Tms o nā huahana hoʻonui ʻole kikoʻī i hana ʻia ma mua o nā amplicons kikoʻī.
ʻIke loa, ʻaʻole hiki ke hoʻohana pono ʻia kēia ʻano ʻike no ka ʻike ʻana i nā pahuhopu i loaʻa i nā haʻahaʻa haʻahaʻa.
ʻO ka mea hoihoi, ʻaʻole i hoʻopaʻa ʻia nā NTC, ʻo ia hoʻi, nā laʻana me ka DNA ʻole i nā huahana hoʻonui (ʻaʻole kikoʻī), e hōʻike ana e hiki i ka DNA genomic hope ke komo i ka amplification/polymerization non-specific.
I kekahi manawa, ʻaʻole hiki ke hoʻoponopono ʻia nā kumu mua a me ka hoʻonui kikoʻī ʻole, akā hiki ke hoʻolālā i kahi ala ʻike ʻaʻole i loaʻa ka hoʻonui kikoʻī ʻole i loko o kekahi kumu hoʻohālike a me NTC (P 5b).
Maʻaneʻi,ʻo ka hoʻopaʻaʻana i ka hoʻonuiʻana i ka manaʻo i hoʻopaʻaʻia me kahi Cq o 35 e hoʻopuka i kahi pihi hoʻoheheʻe kiko'ī.Pēlā nō, ʻaʻole hōʻike nā NTC i nā hōʻailona o ka hoʻonui ʻole kikoʻī.I kekahi manawa, pili paha ka ʻike ʻana i ka waiʻona makuahine, a ʻike ʻia ka hoʻonui ʻole kikoʻī wale nō i kekahi mau haku paʻa, pili paha i nā ʻokoʻa Mg2+.
Paʻa o ka ʻike
ʻO ka optimization o Ta he hana kūpono i ka hōʻoia empirical a me ke kaʻina hana o ka ʻike qPCR.Hāʻawi ia i kahi hōʻike pololei o ka paʻa o ka mea mua i hoʻonohonoho ʻia ma ka hōʻike ʻana i ka mahana (a i ʻole ka pae wela) e hoʻopuka ai i ka Cq haʻahaʻa me ka hoʻonui ʻole i ka NTC.
ʻAʻole ia he mea koʻikoʻi ka ʻokoʻa ʻelua a ʻehā i ka naʻau no ka poʻe me ka hōʻike mRNA kiʻekiʻe, akā no nā hoʻokolohua diagnostic, ʻo ia ke ʻano o ka ʻokoʻa ma waena o nā hopena maikaʻi a me nā hopena maikaʻi ʻole.
ʻOkoʻa paha nā waiwai Ta o nā kumu mua qPCR.ʻAʻole ikaika loa kekahi mau hoʻāʻo, a inā ʻaʻole i hana ʻia ma lalo o ka waiwai Ta maikaʻi loa o nā kumu mua, e hāʻule koke lākou.
He mea koʻikoʻi kēia no ka mea he pilikia pinepine kēia ʻano ʻike i ka honua maoli, a ʻaʻole maikaʻi ka maʻemaʻe o ka hāpana, ka ʻike ʻana o ka DNA, a i ʻole ke kū ʻana o nā DNA ʻē aʻe.
Eia kekahi, ʻokoʻa paha ka helu kope i hoʻopaʻa ʻia ma kahi ākea, a ʻokoʻa paha nā reagents, nā ipu plastik, a i ʻole nā mea hana i nā mea i hoʻohana ʻia i ka hoʻonohonoho ʻana i ka hoʻāʻo.
P6| Hōʻike ka gradient mahana i ka ikaika like ʻole o ka ʻike PCR.
A. E hoʻohana i ka Bioline's Sensifast SYBR mastermix (helu helu BIO-98050) e hana i ka PCR ma ka cDNA i hoʻomākaukau ʻia mai ka RNA lolo kanaka.
B. E hoʻohana i ka mea kani CFX qPCR o Bio-Rad no ka hoʻopaʻa ʻana i ka palapala ʻāina hoʻonui a me ka pihi hoʻoheheʻe o apalene (NM_033207, F: GCCATGGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Kiʻi hoʻonui a me ka pōʻai heheʻe o ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Kiʻi hoʻonui a me ka pihi hoʻoheheʻe o GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs i hoʻopaʻa ʻia ma nā mahana annealing like ʻole, e hōʻike ana i ka ʻokoʻa ma Cq i hoʻopaʻa ʻia ma lalo o kahi gradient wela 7C.
Hōʻike ka P 6 i kahi hopena maʻamau o kahi hoʻāʻo makemake ʻole, kahi i hana ʻia ai ka qPCR me ka hoʻohana ʻana i kahi gradient Tas ma waena o 59C a me 67C (P 6a), me ka hoʻohana ʻana i nā primers no ʻekolu mau genes kikoʻī o ke kanaka.
Hiki ke ʻike ʻia ma ka pakuhi hoʻonui ʻana ʻaʻole mamao loa nā kumu o Opalin mai ka maikaʻi no ka mea he haiki loa ko lākou laulā Ta (Figure 6b), ʻo ia hoʻi, hoʻopuehu nui ʻia nā Cqs, no laila ua hoʻohālikelike ʻia nā Cqs me ko lākou Cqs Haʻahaʻa.
ʻAʻole paʻa kēia ala ʻike a hiki ke alakaʻi i ka suboptimal amplification.No laila, pono e hoʻolālā hou ʻia kēia pālua o nā primers.Eia kekahi, ke hoʻoheheʻe ʻia ka hoʻoheheʻe ʻana (inset) e hōʻike ana he pilikia paha ka kikoʻī o kēia ʻano ʻike, no ka mea, ʻokoʻa ke kahe hehee o kēlā me kēia Ta.
ʻOi aku ka ikaika o ke ala ʻike ACSBG1 i hōʻike ʻia ma P 6c ma mua o ke ala ʻike ʻo Opalin ma luna, akā mamao loa ia mai ka maikaʻi, a hiki ke hoʻomaikaʻi ʻia.
Eia nō naʻe, ke koʻikoʻi nei mākou ʻaʻohe pili pono ma waena o ka paʻa a me ka kikoʻī, no ka mea, ʻo ka pihi hoʻoheheʻe i hana ʻia e kēia ʻano ʻike e hōʻike ana i ka waiwai kiʻekiʻe like ma nā Tas āpau (inset).
Ma ka ʻaoʻao ʻē aʻe, ʻoi aku ka hoʻomanawanui o ka hoʻāʻo ikaika, e hana ana i nā Cqs like ma kahi ākea o Tas, e like me ka hōʻike GFAP i hōʻike ʻia ma P 6d.
ʻO ka ʻokoʻa ma Cqs i loaʻa i ka pae like 8 degere Celsius ma lalo o 1, a ʻo ka dissolution curve (inset) e hōʻoia i nā hiʻohiʻona ʻike i kēia pae wela.He mea pono e hoʻomaopopo he ʻokoʻa loa ka Tas i helu ʻia a me ka laulā Ta maoli.
Nui nā alakaʻi i hoʻolālā ʻia e kōkua i ka poʻe noiʻi e hoʻolālā i nā primers kūpono, ʻo ka hapa nui o ia mau mea i hoʻokumu ʻia i nā lula lōʻihi i hoʻopaʻa ʻia a ua nui ka nānā ʻana i ka 3′end o nā primers.Manaʻo pinepine ʻia e hoʻokomo i kahi G a i ʻole C ma ka hopena 3' a me ʻelua mau kumu G a i ʻole C (GC clamp), akā ʻaʻole ʻoi aku ma mua o ʻelua o nā kumu 5 hope loa.
Ma ka hoʻomaʻamaʻa, hiki i kēia mau lula ke alakaʻi i ka poʻe noiʻi, akā ʻaʻole pololei lākou ma lalo o nā kūlana āpau.
P7 |He liʻiliʻi ka hopena o ka 3′end o ka primer i ka kikoʻī a i ʻole ka pono.
A. Ke kūlana o nā kumu mua no ke kanaka HIF-1α (NM_181054.2) gene.
B. E hoʻohana iā Agilent Brilliant III SYBR ʻO ka waiʻona makuahine ʻōmaʻomaʻo (Cat. No. 600882) e hoʻonui i ʻeono mau mea hoʻāʻo.
C. Kiʻi hoʻonui a me ka pihi hoʻoheheʻe i hoʻopaʻa ʻia e Bio-Rad's CFX qPCR mea kani a me 3′end primers.Hōʻike ʻia nā NTC i ka ʻulaʻula.
D. Cqs mooolelo o kela a me keia mea hoao
Eia kekahi laʻana, kūʻē ka hopena ma P 7 i ka lula 3′end.Hoʻokahi hopena like nā hoʻolālā a pau, me ʻelua hui mua wale nō e alakaʻi i ka hoʻonui ʻole kikoʻī ma NTC.
Eia naʻe, ʻaʻole hiki iā mākou ke kākoʻo i ka hopena o ka clip GC, no ka mea, ma kēia hihia, ʻo ka hoʻohana ʻana iā A a i ʻole T ma ke ʻano he 30 kumu nui ʻaʻole e hōʻemi i ka kikoʻī.
ʻO ka hoʻāʻo C, kahi i pau ai ka F primer ma GGCC, ua hoʻopaʻa i nā Cqs ma nā NTC, e hōʻike ana e makemake paha kekahi e pale i kēia mau kaʻina ma ka hopena 30.Manaʻo mākou ʻo ke ala wale nō e hoʻoholo ai i ke kaʻina 3′end maikaʻi loa o kahi pai mua, ʻo ia ka loiloi i kekahi mau moho kumu mua ma ka hoʻokolohua.
Ka hoʻonui ʻana i ka pono
ʻO ka mea nui, ʻoiai ʻaʻole hiki ke lilo ka ʻike PCR kikoʻī ʻole, hiki ke hoʻoponopono a hoʻonui ʻia ka hoʻonui ʻana i nā ʻano like ʻole ma o ka hoʻololi ʻana i ka enzyme, ka waiʻona makuahine, nā mea hoʻohui, a me nā kūlana kaʻa.
No ka loiloi ʻana i ka pono o ka ʻike PCR, ʻoi aku ka maikaʻi o ka hoʻohana ʻana i kahi dilution serial o 10 a i ʻole 5 mau manawa o ka waikawa nucleic i manaʻo ʻia, ʻo ia hoʻi, ke "ʻano curve maʻamau".
Inā hoʻohana ʻia nā PCR amplicons a i ʻole nā pahuhopu DNA synthetic e hana i kahi pihi maʻamau, pono e hui pū ʻia nā dilutions serial o kēia mau pahuhopu me ka nui mau o ka DNA hope (e like me ka genomic DNA).
P8 |ʻO ka dilution curve e loiloi i ka pono o ka PCR.
A. E hoʻohana i nā kumu mua no HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA a me R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC a me Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (helu helu 600882) no ka PCR a me ka hoʻoheheʻe ʻana i nā kūlana.
B. 100 ng RNA ua ho'ohuli 'ia, diluted 2 manawa, a serially diluted cDNA samples ua diluted 5 manawa i 1 ng kanaka genomic DNA.Hōʻike ʻia ke ʻano hoʻoheheʻe ma ka inset.
C. ʻO ka pane RT, dilution, a me ka dilution serial i hana hou ʻia no ka lua cDNA sample, a ua like nā hopena.
Hōʻike ka P 8 i ʻelua mau ʻāpana maʻamau, me ka hoʻohana ʻana i ke ʻano ʻike like ʻole ma nā ʻano cDNA ʻelua like ʻole, ʻo ka hopena ka hopena like, ma kahi o 100%, a ua like pū ka waiwai R2, ʻo ia hoʻi, ke degere o ka kūpono ma waena o ka ʻikepili hoʻokolohua a me ka laina regression a i ʻole ka ʻikepili Degree of linearity.
Hoʻohālikelike nā ʻāpana maʻamau ʻelua, akā ʻaʻole like loa.Inā ʻo ke kumu ka helu pololei ʻana i ka pahuhopu, pono e hoʻomaopopo ʻia ʻaʻole ʻae ʻia ka hāʻawi ʻana i kahi helu helu kope me ka wehewehe ʻole i ka maopopo ʻole.
P9 |Hoʻopili ʻia ka ʻike ʻole o ke ana me ka hoʻohana ʻana i kahi pihi maʻamau.
A. E hoʻohana i nā kumu mua no GAPDH (NM_002046) e hana i nā kūlana PCR a me ka hoʻoheheʻe ʻana.F: ACAGTTGCCATGTAGACC a me R: TAACTGGTTGAGCACAGG a me Bioline's Sensifast SYBR mastermix (helu helu BIO-98050).
B. Ka pakuhi ho'onui, ka hoohehee a me ka ma'amau i ho'opa'a 'ia me ka Bio-Rad's CFX qPCR mea kani.
C. Kiʻi kiʻi maʻamau a me 95% ka wā hilinaʻi (CI).
D. ʻO ka helu kope a me 95% ka wā hilinaʻi o nā koina Cq ʻekolu i loaʻa mai ka ʻōkuhi dilution.
Hōʻike ʻo P 9 no kahi hoʻāʻo ʻoi loa, ʻo ka ʻokoʻa ʻokoʻa o ka pihi maʻamau hoʻokahi ma kahi o 2 mau manawa (95% ka manawa hilinaʻi, ka liʻiliʻi a hiki i ke kiʻekiʻe), ʻo ia paha ka liʻiliʻi liʻiliʻi loa i hiki ke manaʻo ʻia.
Huahana pili:
He kit PCR kino kino holoholona
Ka manawa hoʻouna: Sep-30-2021
