Ⅰ. E hoʻonui i ka naʻau o ka ʻōnaehana pane:

1. E hoʻokaʻawale i ka RNA kiʻekiʻe:

Loaʻa ka hana cDNA kūleʻa mai ka RNA kiʻekiʻe.Pono ka RNA kiʻekiʻe e hōʻoia i ka lōʻihi o ka lōʻihi a ʻaʻole i loaʻa nā mea hoʻopaneʻe i loaʻa ʻole nā ​​enzyme hoʻopaʻa leo, e like me EDTA a i ʻole SDS.Hoʻoholo ka maikaʻi o ka RNA i ka waiwai nui o ka ʻike kaʻina hiki iā ʻoe ke unuhi i ka cDNA.ʻO ke ʻano hoʻomaʻemaʻe RNA maʻamau he ʻano hana o ka hoʻohana ʻana i ka isocyanate/acidophenol.I mea e pale aku ai i ka haumia o RNase, ua hoʻokaʻawale ʻia ka RNA mai kahi laʻana i loaʻa i ka RNase (e like me ka pancreas) pono e mālama i ka formaldehyde e mālama i ka RNA kiʻekiʻe, ʻoi aku ka maikaʻi no ka mālama lōʻihi.Ua hoʻohaʻahaʻa ʻia ka RNA i lawe ʻia mai ke ake o ka ʻiole ma hope o hoʻokahi pule o ka mālama ʻana i ka wai, ʻoiai ʻo ka RNA i lawe ʻia mai ka ʻiole i paʻa mau ma hope o ʻekolu mau makahiki o ka mālama ʻana i ka wai.Eia kekahi, ʻoi aku ka maʻalahi o nā transcripts ʻoi aku ka nui ma mua o 4kb e ʻike i ka hōʻemi ʻana o RNase ma mua o nā transcripts liʻiliʻi.I mea e hoʻonui ai i ka paʻa o ka waihona RNA hāpana, hiki ke hoʻoheheʻe ʻia ka RNA i loko o kahi methalmamine o ka ion, a mālama ʻia -70 °C.ʻAʻole pono ka Thylide i hoʻohana no ka mālama ʻana i ka RNA i kahi mea like ʻole e hoʻohaʻahaʻa i ka RNA.ʻO ka RNA, ka mea i loaʻa mai ka pancreas, hiki ke mālama ʻia i ka methalmamine no hoʻokahi makahiki.Ke mākaukau ʻoe e hoʻohana i ka RNA, hiki iā ʻoe ke hoʻohana i kēia mau ʻano e hoʻokahe ai i ka RNA: e hoʻohui i ka NaCl i 0.2m a me 4 manawa ka nui o ka ethanol, e waiho i ka lumi wela no 3-5 mau minuke, a me 10,000 × g centrifugal no 5 mau minuke.

2. E hoʻohana i ka transcriptase huli ʻole me ka hana RNaseH (RNaseH-):

Hoʻohui pinepine ʻia nā mea hoʻopaneʻe RNase e hoʻohuli i nā hopena transcription e hoʻonui i ka lōʻihi a me ka hua o ka synthesis cDNA.Hoʻohui ʻia ka mea hoʻopaʻapaʻa RNase i ka hopena o ke kaulahao mua ma ke alo o nā buffers a me nā mea hoʻohaʻahaʻa e like me DTT no ka mea, ʻo ke kaʻina hana pre-cDNA synthesis e denature i ka mea hoʻopaʻa, a laila hoʻokuʻu i nā RNases i hoʻopaʻa ʻia e hoʻohaʻahaʻa i ka RNA.ʻO ka protein RNase inhibitor wale nō ka mea e pale ai i ka hoʻohaʻahaʻa ʻana o RNA e RNase A, B, C, a ʻaʻole e pale i ka RNases ma ka ʻili, no laila pono e mālama ʻia ʻaʻole e hoʻokomo i nā RNases mai nā manamana lima me ka hoʻohana ʻana i kēia mau mea paʻa.

Hoʻololi ka transcriptase i ka huli ʻana o RNA i cDNA.Loaʻa iā M-MLV a me AMV ka hana RNaseH endogenous i kā lākou hana polymerase ponoʻī.Hoʻokūkū ka hana RNaseH me ka hana polymerase no nā kaula heterozygous i hoʻokumu ʻia ma waena o nā RNA templates a me nā DNA primers a i ʻole cDNA extension strands, a hoʻohaʻahaʻa i ka RNA: nā kaula RNA i nā paʻakikī DNA.ʻAʻole hiki ke hoʻohana hou ʻia nā mamana RNA i hoʻohaʻahaʻa ʻia e ka hana RNaseH ma ke ʻano he substrate kūpono no ka synthesis cDNA, e hōʻemi ana i ka hua a me ka lōʻihi o ka synthesis cDNA.No laila, ʻo ka hoʻopau ʻana a i ʻole ka hōʻemi nui ʻana i ka hana RNaseH o ka reverse transcriptase e pōmaikaʻi nui.

ʻO SuperScriptⅡ reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase o RNaseH- a me thermoScript reverse transcriptase, AMV o RNaseH- ua hāʻawi mai i ka cDNA lōʻihi piha ma mua o MMLV a me AMV.Hoʻopili ʻia ka ʻike RT-PCR e ka nui o ka cDNA synthesized.ʻOi aku ka maʻalahi o ka ThermoScript ma mua o AMV.ʻO ka nui o nā huahana RT-PCR i kaupalena ʻia e ka hiki o ka reverse transcriptase e synthesize cDNA, ʻoi aku hoʻi i ka wā e hoʻopili ai i nā Cdnas nui.Hoʻohālikelike ʻia me MMLV, ua hoʻonui nui ʻo SuperScripⅡ i ka hua o nā huahana RT-PCR lōʻihi.Hoʻonui pū ka RNaseH-'s reverse transcriptase i ke kūpaʻa wela, no laila hiki ke hoʻokō ʻia ka hopena ma nā mahana ʻoi aʻe ma mua o 37-42 ℃.Ma lalo o nā kūlana synthesis i manaʻo ʻia, ua hoʻohana ʻia nā oligo(dT) primers a me 10μCi [alpha-p]dCTP.Ua helu ʻia ka huina hana o ke kaulahao mua me ka hoʻohana ʻana i ke ʻano o ka ua.Hoʻopili ʻia ka cDNA holoʻokoʻa me ka hoʻohana ʻana i ka wehe ʻana i ka nui a me ka helu ʻana i kahi gel agarose alkaline.

3. E hoʻonui i ka wela o ka mālama ʻana i ka wela o ka transcription:

ʻO ka mahana paʻa kiʻekiʻe e kōkua i ka wehe ʻana i ke ʻano lua o RNA a hoʻonui i ka hopena o ka hopena.No ka hapa nui o nā mamana RNA, ʻo ka mālama ʻana i ka RNA a me ka primer ma 65°C me ka ʻole o ka buffer a i ʻole ka paʻakai a laila hoʻomālili koke iā lākou i ka hau e hoʻopau i ka hapa nui o nā hale lua a hiki i nā primers ke nakinaki.Eia nō naʻe, loaʻa i kekahi mau hiʻohiʻona ka hana lua, ʻoiai ma hope o ka denaturation thermal.Hiki ke hana ʻia ka hoʻonui ʻana i kēia mau mamana paʻakikī me ka hoʻohana ʻana i ka ThermoScript reverse transcriptase a ma ke kau ʻana i ka hopena reverse transcriptase i nā mahana kiʻekiʻe e hoʻomaikaʻi i ka hoʻonui ʻana.Hiki ke hoʻonui ʻia ka ʻike kikoʻī o ka hoʻopaʻa ʻana i ke kiʻekiʻe, ʻoi aku ka nui o ka hana ʻana o ka cDNA synthesis me ka hoʻohana ʻana i nā kumu kumu kikoʻī gene (GSPS) (e ʻike i ka Mokuna 3).Inā hoʻohana i ka GSP, e hōʻoia i ka like o ka waiwai Tm o ke kumu mua me ka mahana paʻa i manaʻo ʻia.Mai hoʻohana i ka oligo(dT) a me nā kumu mua ma luna o 60 ℃.Pono e hoʻopaʻa ʻia nā primer random ma 25 ℃ no 10 mau minuke ma mua o ka hoʻonui ʻana i 60 ℃.Ma waho aʻe o ka hoʻohana ʻana i nā mahana transcription kiʻekiʻe, hiki ke hoʻomaikaʻi ʻia ka kikoʻī ma o ka hoʻololi pololei ʻana i ka hui ʻana o ka RNA/primary mai ka 65 ℃ denaturing wela i ka reverse transcription e paʻa ana i ka mahana a hoʻohui i kahi hui 2× reaction preheated (cDNA thermal initiation synthesis).Kōkua kēia ʻano hana i ka pale ʻana i ka hoʻopaʻa ʻana o ke kumu intermolecular e kū ana ma nā wela haʻahaʻa.Ma ka hoʻohana ʻana i kahi mea hana PCR e maʻalahi i nā hoʻololi wela he nui e pono ai no RT-PCR.

Hana ʻia ka polymerase hoʻopaʻa i ka wela ma ke ʻano he DNA polymerase i mua o Mg2+ a me RNA polymerase i mua o Mn2+.Hiki iā ia ke mālama i ka wela a hiki i 65 ℃.Eia naʻe, ʻo ka loaʻa ʻana o Mn2+ i ka wā PCR e hōʻemi i ka hilinaʻi, ʻo ia ka mea e hoʻemi ai i ka Tth polymerase no ka hoʻonui precision kiʻekiʻe, e like me ka cDNA cloning.Eia kekahi, ʻoi aku ka maikaʻi o ka Tth ma ka hoʻololi ʻana, e hōʻemi ana i ka naʻau, a no ka mea hiki i kahi enzyme hoʻokahi ke hana i ka hoʻohuli ʻana a me ka PCR, ʻaʻole hiki ke hoʻohana i nā mana hoʻomalu me ka ʻole o ka hoʻololi ʻana e hoʻokaʻawale i nā huahana amplified o cDNA mai nā mea o ka DNA genomic contaminated.

4. Mea hoʻohui e hoʻolalelale ana:

ʻO ka hoʻohui ʻana o nā mea hoʻohui, me ka glycerin a me ka DMSO, i ka hopena synthesis kaulahao mua hiki ke hōʻemi i ka paʻa o ka nucleic acid double strand a hoʻokuʻu i ka hana lua RNA.Hiki ke hoʻohui ʻia i ka 20% glycerin a i ʻole 10% DMSO me ka ʻole o ka hoʻopili ʻana i ka hana a SuperScriptⅡ a i ʻole MMLV.Hiki i ka AMV ke ʻae a hiki i ka 20% glycerol me ka ʻole e hōʻemi i ka hana.No ka hoʻonui ʻana i ka naʻau o RT-PCR ma SuperScriptⅡ hoʻohuli i ka transcription reaction, 10% glycerol hiki ke hoʻohui ʻia a insulated ma 45 ℃.Inā hoʻohui ʻia ka 1/10 o ka huahana retrotranscription-rection i ka PCR, ʻo ka ʻike o ka glycerol i ka hoʻonui ʻana he 0.4%, ʻaʻole lawa ia e kāohi i ka PCR.

5. Hana ʻia ʻo RNaseH:

Hiki ke hoʻomaikaʻi ʻia ka naʻau ma ka mālama ʻana i nā hopena synthesis cDNA me RNaseH ma mua o ka PCR.No kekahi mau la'ana, ua mana'o 'ia 'o ka RNA i loko o ka cDNA synthesis reaction ke pale aku i ka ho'opa'a 'ana i nā huahana i ho'onui 'ia, a laila hiki i ka mālama 'ana i ka RNaseH ke ho'onui i ka na'au.ʻO ka maʻamau, koi ʻia ka mālama ʻana iā RNaseH no ka hoʻonui ʻana i kahi hoʻohālike cDNA kikoʻī lōʻihi lōʻihi, e like me tuberous scherosisⅡ me ke kope haʻahaʻa.No kēia laʻana paʻakikī, ua hoʻonui ʻo RNaseH i ka hōʻailona i hana ʻia e ka cDNA synthesed e SuperScriptⅡ a i ʻole AMV.No ka hapa nui o nā hopena RT-PCR, he koho ka mālama ʻana iā RNaseH no ka mea ʻo ka 95 ℃ insulated PCR denaturation step ka mea maʻamau e hydrolyzes i ka RNA mai ka RNA: DNA complex.

6. ʻO nā ala i hoʻomaikaʻi ʻia no ka ʻike ʻana i nā helu liʻiliʻi o RNA:

He mea paʻakikī loa ka RT-PCR inā loaʻa nā RNA liʻiliʻi.ʻO ka hoʻohui ʻana o ka glycogen ma ke ʻano he mea lawe i ka wā o ka hoʻokaʻawale ʻana o RNA e kōkua i ka hoʻonui ʻana i nā hua liʻiliʻi.Hiki ke hoʻohui ʻia kahi glycogen RNase-free i ka manawa like me Trizol.Hiki ke hoʻoheheʻe ʻia ʻo Glycogen i ka wai a hiki ke noho i ka pae wai me RNA e kōkua i ka ua ma hope.ʻO ka manaʻo i manaʻo ʻia o RNase-free glycogen he 250μg/ml no nā laʻana ma lalo o 50mg o ka ʻiʻo a i ʻole 106 mau pūnaewele moʻomeheu.

ʻO ka hoʻohui ʻana o ka BSA acetylated e hoʻohuli i nā hopena transcription me ka hoʻohana ʻana iā SuperScriptⅡ hiki ke hoʻonui i ka naʻau, a no ka liʻiliʻi o RNA, e hōʻemi i ka nui o SuperScriptⅡ a me ka hoʻohui ʻana i nā ʻāpana 40 o RnaseOut nuclease inhibitor hiki ke hoʻomaikaʻi i ka pae ʻike.Inā hoʻohana ʻia ka glycogen i ka hoʻokaʻawale RNA, ʻo ka hoʻohui ʻana o BSA a i ʻole RNase inhibitors e hoʻohuli i nā hopena transcription me ka hoʻohana ʻana i ka SuperScriptⅡ.

Ⅱ. Hoʻonui i ka kikoʻī o RT-PCR

1. ka hoʻohui ʻana o cNDA:

Hiki ke hoʻohana ʻia ʻekolu mau ala like ʻole no ka hoʻomaka ʻana i ke kaula cDNA synthesis mua, a ʻo ke kikoʻī pili o kēlā me kēia ala e pili ana i ka nui a me ke ʻano o ka cDNA synthesized.

ʻO ke ʻano kumu mua ka mea kikoʻī liʻiliʻi loa o nā ʻano ʻekolu.Hoʻopili ʻia nā kumu mua ma nā wahi he nui i loko o ka transcript e hana i ka cDNA pōkole, ʻāpana lōʻihi.Hoʻohana pinepine ʻia kēia ʻano no ka loaʻa ʻana o 5′ terminal sequences a me cDNA mai RNA templates me nā ʻāpana kūkulu lua a i ʻole me nā pūnaewele hoʻopau i hiki ʻole ke hoʻohuli i ka transcriptase.No ka loaʻa ʻana o ka cDNA lōʻihi loa, pono e hoʻoholo ʻia ka ratio o nā primers i ka RNA i kēlā me kēia laʻana RNA.ʻO ka neʻe mua ʻana o nā primers random mai ka 50 a i ka 250ng no 20μl reaction system.No ka mea, ʻo ka cDNA i hoʻohui ʻia mai ka RNA a pau me ka hoʻohana ʻana i nā primer random he ribosomal RNA ka nui, koho ʻia ka poly(A)+RNA ma ke ʻano he template.

ʻOi aku ka kikoʻī o ka hoʻomaka ʻana o Oligo(dT) ma mua o nā primers random.Hoʻohui ia me ka huelo poly(A) i loaʻa ma ka hope 3′ o ka mRNA i ka hapa nui o nā cell eukaryotic.No ka mea, ʻo ka poly(A)+RNA ma kahi o 1% a 2% o ka RNA a pau, ʻoi aku ka liʻiliʻi o ka nui a me ka paʻakikī o ka cDNA ma mua o ka hoʻohana ʻana i nā kumu mua.Ma muli o kona kūlana kiʻekiʻe, ʻaʻole pono ka oligo(dT) i ka hoʻonui ʻana no ka RNA i ka ratio primer a me ka koho poly(A)+.Manaʻo ʻia e hoʻohana i ka 0.5μg oligo(dT) no ka ʻōnaehana pane 20μl.ʻO ka oligo(dT)12-18 kūpono no ka hapa nui o RT-PCR.Hāʻawi ʻo ThermoScript RT-PCR System i ka oligo(dT)20 ma muli o kona kūpaʻa wela maikaʻi a kūpono i nā mahana paʻa kiʻekiʻe.

ʻO nā kumu kikoʻī Gene-specific (GSP) nā mea kikoʻī kikoʻī maikaʻi loa no ka ʻanuʻu transcription hope.ʻO GSP kahi oligonucleoside antisense hiki ke hoʻohui like me nā kaʻina huakaʻi RNA, ma mua o ka hoʻopili ʻana i nā Rna āpau e like me nā primers random a i ʻole oligo(dT).ʻO nā lula i hoʻohana ʻia no ka hoʻolālā ʻana i nā PCR primers e pili pū ana i ka hoʻolālā ʻana o ka hopena transcription reverse GSP.Hiki i ka GSP ke ka'ina like me ke kumu ho'onui i ho'opili 'ia ma ka hope o mRNA3′, a i 'ole hiki ke ho'olālā 'ia ka GSP e ho'opili 'ia i lalo me ke kumu ho'onui ho'ohuli.No kekahi mau mea i hoʻonui ʻia, pono e hoʻolālā i ʻoi aku ma mua o hoʻokahi kumu antisense no ka RT-PCR kūleʻa no ka mea hiki i ke ʻano lua o ka RNA i hoʻopaʻa ʻia ke pale i ka paʻa ʻana o ka primer.Manaʻo ʻia e hoʻohana i ka 1pmol antisense GSP i ke kaulahao mua synthesis reaction system o 20μl.

2. E hoʻonui i ka wela o ka mālama ʻana i ka wela o ka unuhi ʻana:

I mea e hoʻohana pono ai i ka kikoʻī GSP, pono e hoʻohana i ka transcriptase hoʻohuli me ke kūpaʻa wela kiʻekiʻe.Hiki ke hoʻopaʻa ʻia ka transcriptase huli ʻana i ka wela ma nā mahana kiʻekiʻe e hoʻonui ai i ka paʻakikī.No ka laʻana, inā hoʻopili ʻia kahi GSP ma 55°C, a laila ʻaʻole i hoʻohana piha ʻia ka kikoʻī o GSP inā hana ʻia ka unuhi hoʻohuli ʻana ma 37°C me ka haʻahaʻa haʻahaʻa me ka hoʻohana ʻana i ka AMV a i ʻole M-MLV.Eia nō naʻe, hiki i ka SuperScripⅡ a me ThermoScript ke hana i ka 50 ℃ a i ʻole ke kiʻekiʻe, kahi e hoʻopau ai i nā huahana nonspecific i hana ʻia ma nā haʻahaʻa haʻahaʻa.No ka mea kiko'ī loa, hiki ke hoʻololi pololei ʻia ka hui ʻana o ka RNA/ primer mai ka mahana denaturation 65 ℃ a i ka wela hoʻopaʻa paʻa ʻana i ka transcription me ka hoʻohui ʻana o kahi hui 2 x reaction preheated (hoʻomaka wela o ka synthesis cDNA).Kōkua kēia i ka pale ʻana i ka hoʻopaʻa ʻana i ke kumu ma waena o nā molekala ma nā wela haʻahaʻa.ʻO ka hoʻohana ʻana i kahi mea hana PCR e maʻalahi i nā hoʻololi wela he nui e pono ai no RT-PCR.

3. E hoemi i ka ino DNA genomic:

ʻO kekahi pilikia me RT-PCR ʻo ia ka RNA e hoʻohaumia i ka DNA genomic.ʻO ka hoʻohana ʻana i nā ʻano hoʻokaʻawale RNA maikaʻi loa, e like me Trizol Reagent, e hōʻemi ana i ka contamination DNA genomic i nā hoʻomākaukau RNA.No ka pale ʻana i nā huahana i hana ʻia mai ka DNA genomic, hiki ke mālama ʻia ka RNA me ka DnasⅠ amplification grade e wehe i ka DNA i hoʻohaumia ma mua o ka hoʻohuli ʻana i ka palapala.Mālama ʻia nā laʻana ma 65 ℃ ma 2.0mM EDTA no 10 min e hoʻopau i ka DNaseⅠ digestion.Hoʻopili ʻo EDTA i nā ion magnesium no ka pale ʻana i ka hydrolysis RNA i hilinaʻi i ka magnesium i loaʻa i nā wela kiʻekiʻe.

I mea e hoʻokaʻawale ai i ka cDNA i hoʻonui ʻia mai ka huahana hoʻonui DNA genome, hiki ke hoʻolālā ʻia nā primers e hoʻopili kaʻawale me ka exon i hoʻokaʻawale ʻia.ʻOi aku ka pōkole o nā huahana PCR i loaʻa mai ka cDNA ma mua o nā mea i loaʻa mai ka DNA genomic i hoʻohaumia ʻia.Hana ʻia ka hoʻokolohua ʻokoʻa me ka unuhi ʻole ʻana ma kēlā me kēia RNA template e hoʻoholo ai inā he ʻāpana i hāʻawi ʻia mai ka genomic DNA a i ʻole cDNA.Loaʻa nā huahana PCR i ka loaʻa ʻole o ka transcription reverse mai ka genome.

Huahana pili

RT-PCR maʻalahi^ᵀᴹI (Hoʻokahi Kaʻina)

-ʻO ka pahu hoʻokahi-ʻanuʻu hiki ke hoʻokō i ka transcription hoʻohuli a me ka PCR i loko o ka paipu hoʻokahi.Pono wale ia e hoʻohui i ka RNA template, nā kumu PCR kikoʻī a me ka RNase-Free ddH₂O.

- Hiki ke hoʻokō koke ʻia ka loiloi nui o ka RNA i ka manawa maoli.

-Ke hoʻohana nei ka pahu i kahi reagent transcription kū hoʻokahi Foregene a me Foregene HotStar Taq DNA Polymerase i hui pū ʻia me kahi ʻōnaehana kūʻokoʻa e hoʻomaikaʻi maikaʻi i ka pono amplification a me ka kikoʻī o ka pane.

-ʻO ka ʻōnaehana hopena maikaʻi e hana i ka hopena i ʻoi aku ka kiʻekiʻe o ka ʻike ʻike, ʻoi aku ka ikaika o ka thermal stability, a ʻoi aku ka maikaʻi o ka hoʻomanawanui.

RT Easy II(Me GDNase) Master Premix No First-Strand CDNA Synthesis No PCR Manawa maoli Me GDNase

-Ka hiki ke hoʻopau i ka gDNA, hiki ke wehe i ka gDNA i ka template i loko o 2 mau minuke.

-Efficient reverse transcription system, he 15 minuke wale no e hoopau ai i ka synthesis o ka cDNA strand mua.

- Nā hiʻohiʻona paʻakikī: hiki ke hoʻohuli ʻia nā hiʻohiʻona me ka maʻiʻo GC kiʻekiʻe a me ka hoʻolālā lua paʻakikī me ka hana kiʻekiʻe.

-High-sensitivity reverse transcription system, pg-level templates hiki ke loaʻa i ka cDNA kiʻekiʻe.

-ʻO ka ʻōnaehana transcription reverse he paʻa wela kiʻekiʻe, ʻo ka mahana hopena maikaʻi loa ʻo 42 ℃, a loaʻa mau ka hana transcription hoʻohuli maikaʻi ma 50 ℃.