ʻO ka hoʻokolohua RT-qPCR e loaʻa i ka RNA extraction a me ka loiloi maikaʻi, hoʻohuli i ka transcription a me ka qPCR ʻekolu mau ʻanuʻu, ʻo kēlā me kēia ʻanuʻu he nui ka mālama ʻana, e hoʻolauna mākou i nā kikoʻī ma lalo.

Ⅰ.ʻO ka loiloi maikaʻi o RNA

Ma ka hoʻokolohua RT-qPCR, ma hope o ka pau ʻana o ka unuhi ʻana o RNA, pono e loiloi ʻia ka maikaʻi o ka RNA, a hiki ke hoʻokō ʻia ka hoʻokolohua hahai ma hope o ke kūpono.Loaʻa nā ʻano loiloi i ka spectrophotometer, Agilent gel electrophoresis, Agilent 2100 analysis, ma waena o ka mea maʻamau i hoʻohana ʻia ka spectrophotometer a me ka ʻano ʻike electrophoresis gel agarose.Pono e hoʻomaopopo ʻia e pono e hoʻohana pū ʻia kēia mau ʻano ʻelua e hoʻopau i ka ʻike a me ka nānā ʻana o ka ʻike RNA, ka maʻemaʻe a me ka pololei, i mea e hōʻoia ai i ka maikaʻi o ka RNA.

ʻO ka pahu hoʻokaʻawale RNA pili: 

Kelepona Huina RNA Isolation Kit

Hiki ke loaʻa ka RNA piha hoʻomaʻemaʻe kiʻekiʻe a kiʻekiʻe mai nā ʻano moʻomeheu like ʻole i 11min.

Huina Hoʻokaʻawale RNA Holoholona

Hoʻopau wikiwiki a maikaʻi hoʻi i ka RNA holoʻokoʻa kiʻekiʻe-maʻemaʻe a kiʻekiʻe mai nā ʻiʻo holoholona like ʻole.

ʻIkepili kiʻi kiʻi:

Hoʻohana nui ʻia ka spectrophotometer e hoʻoholo i ka ʻike a me ka maʻemaʻe o RNA, akā ʻaʻole hiki ke ʻike i ka pono o ka RNA a me ke koena genomic.Ma waena o lākou, ʻo A260/280 a me A260/230 nā ʻāpana koʻikoʻi no ka ʻike maʻemaʻe RNA, a hiki ke ʻike ʻia ka maʻemaʻe RNA e like me ka loli o kā lākou mau waiwai.

1. 1.9< A260/280< 2.1, e hoike ana he maikai ka maemae o RNA;A260/280<1.9, e hōʻike ana he koena protein i loko o RNA;A260/280> 2.1, e hōʻike ana i ka hoʻohaʻahaʻa hapa o ka RNA, hiki ke hōʻoia hou ʻia e ka electrophoresis gel agarose.

2. 2.0< A260/230< 2.2, e hoike ana he maikai ka maemae o RNA;A260/230< 2.0, e hōʻike ana aia paha nā koena o nā mea hoʻopaʻa ola i loko o RNA, e like me nā phenols, ethanol a i ʻole nā ​​kō.

ʻO ka electrophoresis gel agarose:

Hiki i ka Agarose gel electrophoresis assay ke kālailai i ka pono o ka RNA, genome a me nā koena protein, akā ʻaʻole hiki ke helu pololei i ka neʻe ʻana o ka RNA a ʻike paha i ke koena o nā reagents organik.E lawe i nā hōʻailona RNA eukaryotic no ka laʻana:

1. Ua kau ʻia ka RNA i ka electrophoresis gel agarose.Inā ʻekolu mau pūʻulu hoʻokahi o 28sRNA, 18sRNA a me 5.8sRNA ma ka palapala ʻāina, e hōʻike ana ua paʻa ka RNA i unuhi ʻia.Inā loaʻa kahi hanana huki, hōʻike ia i ka hoʻohaʻahaʻa hapa o RNA.

2. Inā loaʻa kahi pūnaʻi ʻālohilohi ma waena o ka lua glue a me ka band 28sRNA, aia paha ke koena DNA genomic.

3. Inā ʻike ʻia nā kaula i loko o ka lua glue, e hōʻike ana he koena o ka protein a me nā mea macromolecular ʻē aʻe.

Ⅱ. Hoʻihoʻi i ka palapala

Ma hope o ka pau ʻana o ka unuhi ʻana o RNA, pono e hoʻohuli ʻia i cDNA no nā hoʻokolohua ma hope, no laila he mea nui ka hana hoʻohuli.E hoʻokomo ʻia ka transcription reverse mai ke koho ʻana o ka reverse transcriptase a me ka primer:

Hoʻololi i ke koho transcriptase:

ʻO nā transcriptases hoʻohuli maʻamau ka AMV RTase a me MMLV RTase.He hana ikaika ka RNase H o AMV RTase, ka lōʻihi o ka synthesis pōkole, ka nui synthesis haʻahaʻa a me ke kūpaʻa wela maikaʻi (42 ~ 55 ℃).Nawaliwali ka hana RNase H o MMLV RTase, lōʻihi ka lōʻihi o ka synthesis, kiʻekiʻe ka nui o ka synthesis, a maikaʻi ʻole ke kūpaʻa wela (37 ~ 42 ℃).

Ma muli o ka hana ʻana o ka enzyme RNase H i ka hoʻohaʻahaʻa ʻana i ka laʻana RNA, pono e koho pono ʻia ka MMLV me ka hana RNase H nāwaliwali i ka wā o ka hoʻololi ʻana, a ma hope o ka ʻenekini genetic, ua hiki ke kūpaʻa wela o MMLV i kahi lele qualitative.Lawe ʻo ForegeneForeasy Reverse Transcriptase(M-MLV no ka unuhi huli ʻana) ma ke ʻano he laʻana, he transcriptase hou hou i hōʻike ʻia ma E. coli engineered bacteria me ka hoʻohana ʻana i ka ʻenehana recombination genetic.He DNA polymerase ia e hoʻohui i kahi kaula DNA hoʻohui mai RNA, DNA, a i ʻole RNA: DNA hybrid.ʻAʻohe ona hana RNase H, kūpaʻa ikaika, pili RNA ikaika, a me ka ʻike kiʻekiʻe.

 

Foreasy Reverse Transcriptase(M-MLV no ka unuhi huli ʻana)

Ke koho ʻana i ka mea hoʻomaka:

ʻO ka maʻamau, hāʻule nā ​​kumu mua RT i ʻekolu mau ʻāpana: oligo dT, nā kumu mua, a me nā kumu kumu kikoʻī.E koho i nā kumu mua kūpono no ka hoʻohana ʻana e like me nā koi hoʻokolohua like ʻole.

1. Inā no ka eukaryotic kumu ka la'ana a ho'ohana 'ia ka cDNA hope no ka ho'onui PCR ma'amau, ua paipai 'ia 'o Oligo (dT);Inā hoʻohana wale ʻia ka hoʻokolohua ma hope no qPCR, ʻōlelo ʻia ʻo Oligo (dT) e hui pū ʻia me nā primers random no ka hoʻomaikaʻi ʻana i ka maikaʻi o ka hoʻohuli ʻana.

2. Inā no ka prokaryotes ka la'ana, pono e koho 'ia nā Random Primers a i 'ole nā ​​gene specific primers no ka ho'ololi 'ana.

Ⅲ.qPCR

Hoʻopili nui ʻia ka nui o ka fluorescence mai ke koho ʻana i nā ʻano quantitative, nā kumu hoʻolālā kumu mua, ke koho ROX, ka hoʻonohonoho ʻana o ka ʻōnaehana a me ka hoʻonohonoho ʻana i nā kūlana, etc.

Ke koho ʻana i nā ʻano quantitative:

Hoʻokaʻawale ʻia nā ʻano quantitative i nā ʻano quantitative pili a me nā ʻano quantitative piha.Hiki ke hoʻohana ʻia ka quantification pili no ka ʻike ʻana i ka hopena o kekahi mau ʻano lapaʻau ma ka hōʻike ʻana o ke ʻano, ʻike i ka ʻokoʻa o ka hōʻike ʻana i nā manawa like ʻole a hoʻohālikelike i ka ʻokoʻa o ka hōʻike ʻana i nā ʻiʻo like ʻole.Hiki ke ʻike i ka nui o ka nucleic acid i loko o ka maʻi virus a pēlā aku.I ka hana ʻana i nā hoʻokolohua, pono mākou e koho i nā ʻano hana quantitative kūpono e like me kā mākou hoʻokolohua ponoʻī.

Nā loina hoʻolālā kumu:

ʻO ka hoʻolālā o ka primer no qPCR pili pono i ka hoʻonui ʻana a me ka kikoʻī o ka huahana.No laila, ʻo ka hoʻolālā pololei ʻana i nā primers maikaʻi ka hana mua o ka qPCR kūleʻa.I ka hoʻolālā ʻana o ka primer, pono e hoʻolohe i nā loina aʻe i ka wā e hālāwai ai i ke kumu o ka hoʻolālā kumu maʻamau:

1. Hoʻomalu ʻia ka lōʻihi o ka ʻāpana pahuhopu ma waena o 100 a me 300 bp;

2. Hoʻolālā cross-exon e pale i ka mana o ka DNA genomic;

3. Pono e ho'āʻoʻia nā primers i hoʻolālāʻia no ka hoʻonuiʻana i ka maikaʻi, a aia wale nō i ka hikiʻana o ka pono hoʻonui i ka maʻamau (90-110%) hiki ke hoʻohanaʻia no nā hoʻokolohua quantitative;

4. Hoʻomaʻamaʻa pinepine ʻia ka manaʻo kumu ma waena o 0.1uM a me 1.0uM.

Koho oROX:

I ke kaʻina hana o ka quantitative reaction, hiki i ka ROX ke hoʻoponopono i ka ʻokoʻa o ke ala ʻokoʻa, ka hewa pipetting a i ʻole ka nui o ka ʻokoʻa i hoʻokumu ʻia e ka evaporation a me ka condensation uniformly, e hoʻomaikaʻi i ka hoʻihoʻi ʻana o nā hopena.Eia naʻe, pono e hoʻomaopopo ʻia e pili ana ke koho ʻana o ROX i ka mea kani.Inā loaʻa i ka mea hana qPCR ka hana o ka hoʻoponopono ʻana i ka ʻokoʻa ma waena o nā lua, ʻaʻole pono e hoʻohui iā ROX;a i ʻole, pono ia e hoʻohui i ka hoʻoponopono ROX.Pono nā hoa liʻiliʻi i ke kūʻai ʻana i nā reagents e like me ka mea i hoʻohana ʻia e koho i ka ROX kūpono, e pale i nā hewa ma hope.

Hoʻomākaukau i ka ʻōnaehana pane:

ʻO ka nui o ka hopena o 20ul a me 50ul makemake ʻia.Pono e noʻonoʻo ʻia nā mea i lalo i ka wā i kūkulu ʻia ai ka ʻōnaehana:

1. Pono e hoʻomākaukau ʻia ka ʻōnaehana pane e ka ea ma ka papa hana ultra-clean, ddH hou₂Hoʻohana ʻia ʻo O no kēlā me kēia hoʻokolohua;

2. Pono kēlā me kēia hoʻokolohua e hoʻomākaukau i ka NTC e hōʻoia inā he haumia i loko o ka ʻōnaehana, a pono kēlā me kēia pālua o nā primers e hana i ka NTC i ka wā e hoʻomākaukau ai i ka ʻōnaehana;

3. No ka ʻike inā he koena gDNA i loko o ka template RNA, hiki ke hoʻomākaukau ʻia ka NRT no kēlā me kēia laʻana no ka ʻike;

4. I ka hoʻomākaukau ʻana i ka ʻōnaehana, ʻōlelo ʻia e hana ma ka liʻiliʻi o 3 mau ʻenehana hou no hoʻokahi laʻana;

5. Inā he cDNA ka la'ana, pono e ho'ohehe'e i 5-10 manawa e ho'emi i ka hopena inhibition o ka'ōnaehana transcription reverse ma ka ho'okolohua qPCR.ʻOi aku ka maikaʻi o ka ʻimi ʻana i ka nui ma ka gradient, i hāʻule ka waiwai CT ma waena o 20-30;

6. E hoʻoholo i ka helu i koi ʻia o nā hopena, e hoʻonui i ka 5-10% ma ke kumu o ka helu o nā hopena, a e helu i ka helu hoʻonohonoho leo;

7, ua hoʻomākaukau ʻia ka ʻōnaehana me ka hoʻohana ʻana i ke kumu premix, hui ʻia ma hope o ka centrifugation a hōʻoia i ka ʻole o nā ʻōpū;

8, e like me ka hiki ke koho i ke kākoʻo consumables.

Kit RT-qPCR pili