Hoʻokumu ʻia ʻo RT-qPCR mai ka ʻenehana PCR maʻamau.Hoʻohui ia i nā kemika fluorescent (ʻulaʻula fluorescent a i ʻole fluorescent probes) i ka ʻōnaehana hopena PCR maʻamau, a ʻike i ka PCR annealing a me ke kaʻina hoʻonui i ka manawa maoli e like me kā lākou mau hana luminescent like ʻole.Hoʻohana ʻia nā hoʻololi hōʻailona Fluorescent i ke kikowaena e helu i ka nui o ka loli huahana i kēlā me kēia pōʻai o PCR.I kēia manawa, ʻo nā ʻano hana maʻamau ʻo ke ʻano dye fluorescent a me ke ʻano probe.

ʻO ke ʻano o ka waihoʻoluʻu fluorescent:
ʻAʻole hoʻokuʻu ʻia kekahi mau mea hoʻonaninani fluorescent, e like me SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, a me nā mea ʻē aʻe.No laila, i ka hoʻomaka ʻana o ka hopena PCR, ʻaʻole hiki i ka mīkini ke ʻike i ka hōʻailona fluorescent.Ke hele ka hopena i ka annealing-extension (ʻelua-step method) a i ʻole ka hoʻonui ʻana (ʻekolu-step method), wehe ʻia nā kaula pālua i kēia manawa, a me ka DNA polymerase hou I ka wā synthesis strand, hoʻohui ʻia nā molekala fluorescent i ka awāwa liʻiliʻi dsDNA a hoʻopuka i ka fluorescence.Ke piʻi aʻe ka helu o nā pōʻai PCR, ʻoi aku ka nui o nā mea pena me ka dsDNA, a hoʻonui mau ʻia ka hōʻailona fluorescent.E lawe i ka SYBR Green Ⅰ i laʻana.
Ke ala ʻimi:
ʻO Taqman probe ka mea hoʻohana maʻamau hydrolysis probe.Aia kekahi pū'ulu fluorescent ma ka hopena 5' o ka probe, ma'amau FAM.ʻO ka probe ponoʻī he kaʻina hoʻohui i ka gene i manaʻo ʻia.Aia kekahi pūʻulu hoʻopiʻi fluorescent ma ka hopena 3' o ka fluorophore.E like me ka loina o ka fluorescence resonance ikehu hoʻoili (Förster resonance ikehu hoʻoili, FRET), i ka wa a ka mea hoike fluorescent pūʻulu (donor fluorescent mole) a me ka quenching fluorescent pūʻulu (acceptor fluorescent mole) I ka excitation spectrum overlaps a me ka mamao kokoke loa (7-10nm), hiki i ka excitation o ka autofluorescence i loko o ka mea hāʻawi i ka fluorescent molecule. ned.No laila, i ka hoʻomaka ʻana o ka hopena PCR, i ka wā e manuahi a paʻa ka probe i loko o ka ʻōnaehana, ʻaʻole e hoʻokuʻu ka fluorescent pūʻulu nūhou.Ke hoʻopili ʻia, hoʻopaʻa ka primer a me ka probe i ka template.I ka wā hoʻonui, hoʻomau ka polymerase i nā kaulahao hou.He 5′-3′ ka hana exonuclease ka DNA polymerase.Ke hiki aku i ka probe, e hydrolyze ka DNA polymerase i ka probe mai ka la'ana, e ho'oka'awale i ka hui fluorescent reporter mai ka hui fluorescent quencher, a e hoʻokuʻu i ka hōʻailona fluorescent.No ka mea aia ka pilina hoʻokahi ma waena o ka probe a me ka template, ʻoi aku ka maikaʻi o ke ʻano probe ma mua o ke ʻano dye ma ke ʻano o ka pololei a me ka naʻau o ka hoʻāʻo.

Fig 1 Kumu o qRT-PCR

Hoʻolālā kumu
Nā loina:

Pono e hoʻolālā ʻia nā primers ma ka ʻāpana i mālama ʻia o ka moʻo nucleic acid a loaʻa kahi kikoʻī.

ʻOi aku ka maikaʻi o ka hoʻohana ʻana i ke kaʻina cDNA, a ʻae ʻia ke kaʻina mRNA.Inā ʻaʻole, e ʻimi i ka hoʻolālā ʻāina cds o ke kaʻina DNA.
ʻO ka lōʻihi o ka huahana quantitative fluorescent he 80-150bp, ʻo ka lōʻihi loa he 300bp, ʻo ka lōʻihi kumu ma waena o 17-25 kumu, a ʻo ka ʻokoʻa ma waena o nā kumu mua a me lalo ʻaʻole pono e nui loa.

Aia ka ʻike G+C ma waena o 40% a me 60%, a ʻo 45-55% ka mea maikaʻi loa.
Aia ka waiwai TM ma waena o 58-62 degere.
E hoʻāʻo e pale i nā dimer primer a me nā dimer ponoʻī, (ʻaʻole i ʻike ʻia ma mua o 4 mau pai o nā kumu hoʻohui hui) ʻano lauoho lauoho, inā ʻaʻole hiki ke pale ʻia, e hana i ka ΔG<4.5kJ/mol* Inā ʻaʻole hiki iā ʻoe ke hōʻoia i ka wehe ʻia ʻana o ka gDNA i ka wā o ka hoʻololi ʻana Maʻemaʻe, ʻoi aku ka maikaʻi o ka hoʻolālā ʻana i nā primers o ka intron *3′ ʻaʻole hiki ke hoʻololi ʻia ka ʻāpana o ka intron *3′, ʻaʻole hiki ke hoʻololi ʻia ka ʻāpana A/G2, ʻaʻole hiki ke hoʻololi ʻia ka ʻāpana A/G, a ʻaʻole hiki ke hoʻololi ʻia ka ʻāpana A/GC ) nā kumu mua a me nā mea ʻole
kikoʻī ʻO ka homology o ke kaʻina heterogeneously amplified ʻoi aku ka maikaʻi ma lalo o 70% a i ʻole he 8 homology kumu hoʻohui.
waihona:
Huli ʻo CottonFGD ma nā huaʻōlelo
Hoʻolālā kumu mua:
IDT-qPCR hoʻolālā kumu

Fig2 IDT ʻaoʻao mea hana hoʻolālā kumu mua

Fig3 hōʻike ʻaoʻao hopena
Hoʻolālā o ka lncRNA primers:
lncRNA:nā ʻanuʻu like me ka mRNA.
miRNA:ʻO ke kumu o ke ʻano kumu-loop: No ka mea, ʻo nā miRNA a pau he mau kaʻina pōkole ma kahi o 23 nt, ʻaʻole hiki ke hoʻokō ʻia ka ʻike PCR pololei, no laila hoʻohana ʻia ka hāmeʻa kaʻina kumu.ʻO ke kaʻina o ka stem-loop he DNA stranded hoʻokahi ma kahi o 50 nt, hiki iā ia ke hana i kahi ʻano lauoho lauoho iā ia iho.3 'Hiki ke hoʻolālā ʻia ka hopena e like me ke kaʻina hoʻohui i ka ʻāpana hapa miRNA, a laila hiki ke hoʻopili ʻia ka miRNA pahuhopu i ke kaʻina kumu-loop i ka wā o ka hoʻohuli ʻana, a hiki i ka lōʻihi holoʻokoʻa ke hiki i 70bp, ʻo ia ka laina me ka lōʻihi o ka huahana amplified i hoʻoholo ʻia e qPCR.Hoʻolālā kumu mua o ka miRNA.
ʻIke kikoʻī hoʻonui:
ʻIkepili pahū pūnaewele: Puhi CottonFGD ma ke ʻano like
Pahu kūloko: E nānā i ka hoʻohana ʻana i ka Blast + e hana i ka pahū kūloko, hiki i ka Linux a me nā macos ke hoʻokumu pololei i kahi waihona kūloko, hiki ke hana ʻia ka ʻōnaehana win10 ma hope o ka hoʻokomo ʻana i ka ubuntu bash.E hana i ka waihona pahū kūloko a me ka pahū kūloko;wehe i ka ubuntu bash ma win10.
'Ōlelo Aʻo: ʻO ka pulupulu uka a me ka pulupulu mokupuni o ke kai he mau mea kanu tetraploid, no laila, ʻelua a ʻoi aku ka hopena o ka pahū.I ka wā ma mua, ʻo ka hoʻohana ʻana i nā cd NAU ma ke ʻano he waihona e hana ai i ka blast e loaʻa paha i ʻelua mau genes homologous me nā ʻokoʻa SNP wale nō.ʻO ka maʻamau, ʻaʻole hiki ke hoʻokaʻawale ʻia nā genes homologous ʻelua e ka hoʻolālā mua, no laila ua mālama ʻia lākou e like me ka like.Inā loaʻa kahi indel maopopo, hoʻolālā pinepine ʻia ka primer ma ka indel, akā hiki ke alakaʻi kēia i ke ʻano lua o ka primer ʻO ka ikaika manuahi e piʻi aʻe, e alakaʻi ana i ka emi ʻana o ka pono amplification, akā ʻaʻole hiki ke pale ʻia kēia.

Ka ʻike ʻana o ka hoʻolālā lua mua:
Nā ʻanuʻu:wehe i ka oligo 7 → hoʻokomo i ke kaʻina hoʻokomo → pani sub-window → mālama → huli i ka primer ma ka template, kaomi ctrl+D e hoʻonohonoho i ka lōʻihi kumu → hoʻopaʻa i nā ʻano hana lua, e like me ke kino dimerization ponoʻī, heterodimer, hairpin, mismatch, a pēlā aku.Maikaʻi ka hopena o ke kumu mua, ʻaʻohe ʻano dimer a me ka lauoho lauoho, ʻaʻohe kumu hoʻohui mau, a ʻo ka waiwai piha o ka ikehu manuahi ʻoi aku ka liʻiliʻi ma mua o 4.5, ʻoiai ke hōʻike ʻana o ka primer hope i ka hoʻomau ʻO nā kumu 6 ua hoʻohui, a ʻo ka ikehu manuahi ʻo 8.8;Eia kekahi, ua ʻike ʻia kahi dimer koʻikoʻi ma ka hopena 3, a ʻike ʻia kahi dimer o 4 mau kumu.ʻOiai ʻaʻole kiʻekiʻe ka ikehu manuahi, hiki i ka 3′ dimer Chl ke hoʻopilikia koʻikoʻi i ka kikoʻī o ka amplification a me ka pono hoʻonui.Eia kekahi, pono e nānā i nā hairpins, heterodimers, a me nā mismatches.

Fig3 oligo7 hopena ʻike
ʻIke pono hoʻonui ʻia:
Hoʻopilikia koʻikoʻi ka hoʻonui ʻana o ka hopena PCR i nā hopena PCR.Eia kekahi ma qRT-PCR, he mea koʻikoʻi ka hana amplification no nā hopena quantitative.Wehe i nā mea ʻē aʻe, nā mīkini a me nā kuʻina i loko o ka pale pale.He hopena nui ka maikaʻi o nā primers i ka hoʻonui ʻana o ka qRT-PCR.I mea e hōʻoiaʻiʻo ai i ka pololei o nā hualoaʻa, pono e ʻike ka nui o ka fluorescence pili a me ka helu fluorescence piha i ka pono o ka amplification o nā primers.Ua ʻike ʻia ʻo ka maikaʻi o ka qRT-PCR amplification pono ma waena o 85% a me 115%.ʻElua mau ala:
1. Keʻano kaʻapuni maʻamau:
a.Hoʻohui i ka cDNA
b.ʻO ka dilution gradient
c.qPCR
d.Linear regression equation no ka helu ʻana i ka pono hoʻonui
2. LinRegPCR
He polokalamu ʻo LinRegPCR no ka nānā ʻana i ka ʻikepili RT-PCR i ka manawa maoli, i kapa ʻia hoʻi ka ʻikepili quantitative PCR (qPCR) e pili ana i ka SYBR Green a i ʻole kemika like.Hoʻohana ka papahana i nā ʻikepili i hoʻoponopono ʻole ʻia, hana i ka hoʻoponopono kumu ma kēlā me kēia laʻana.Mai ka pali o kēia laina e helu ʻia ka pono o ka PCR o kēlā me kēia laʻana.Hoʻohana ʻia ka pono PCR no kēlā me kēia amplicon a me ka waiwai Ct no kēlā me kēia laʻana no ka helu ʻana i ka neʻe ʻana o ka hoʻomaka ʻana i kēlā me kēia laʻana, i hōʻike ʻia ma nā ʻāpana fluorescence arbitrary.ʻO ka hoʻokomo ʻana i ka ʻikepili a me ka hoʻopuka ʻana ma o ka papapalapala Excel.Hoʻohālike wale nō
Pono ka hui ʻana, ʻaʻohe gradient
pono nā ʻanuʻu:(E lawe i ka Bole CFX96 ma ke ʻano he laʻana, ʻaʻole i ka mīkini me ka ABI maopopo)
hoʻokolohua:he hoʻokolohua qPCR maʻamau.
huaʻikepili qPCR:Hiki iā LinRegPCR ke ʻike i ʻelua ʻano o nā faila: RDML a i ʻole ka helu ʻana i ka hopena Amplification.ʻO ka ʻoiaʻiʻo, ʻo ia ka waiwai ʻike manawa maoli o ka helu pōʻaiapuni a me ka hōʻailona fluorescence e ka mīkini, a loaʻa ka amplification ma ke kālailai ʻana i ka waiwai hoʻololi fluorescence o ka pono o ka māhele laina.
Koho ʻikepili: Ma ke kumumanaʻo, pono e hoʻohana ʻia ka waiwai RDML.Ua manaʻo ʻia ʻo ka pilikia o kaʻu kamepiula ʻaʻole hiki i ka polokalamu ke ʻike i ka RDML, no laila, loaʻa iaʻu ka waiwai hoʻopuka excel e like me ka ʻikepili kumu.Manaʻo ʻia e hana mua i ka nānā ʻana i ka ʻikepili, e like me ka hiki ʻole o ka hoʻohui ʻana i nā laʻana, a me nā mea ʻē aʻe.

Fig5 qPCR hoʻokuʻu ʻikepili

Fig6 koho o na laana moho

Komo ʻikepili:E wehe i nā hualoaʻa hoʻonui hōʻoia.xls, → wehe LinRegPCR → faila → heluhelu mai ka excel → koho i nā ʻāpana e like me ka hōʻike ʻana ma ka Figure 7 → OK → kaomi i ka hoʻoholo i nā palena.

Fig7 nā ʻanuʻu o ka hoʻokomo ʻikepili linRegPCR

Ka hopena:Inā ʻaʻohe hana hou, ʻaʻole pono ka hui ʻana.Inā loaʻa ka hana hou, hiki ke hoʻoponopono ʻia ka hui ʻana ma ka hōʻuluʻulu laʻana, a hoʻokomo ʻia ka inoa o ka gene i loko o ka mea hōʻike, a laila e hui pū ʻia ke ʻano like.ʻO ka hope, kaomi i ka faila, export excel, a nānā i nā hopena.E hōʻike ʻia ka pono amplification a me nā hopena R2 o kēlā me kēia luawai.ʻO ka lua, inā e puʻunaue ʻoe i nā pūʻulu, e hōʻike ʻia ka hoʻoponopono awelika amplification pono.E hōʻoia i ka pono o ka amplification o kēlā me kēia primer ma waena o 85% a me 115%.Inā ʻoi aku ka nui a i ʻole ka liʻiliʻi loa, ʻo ia hoʻi, ʻilihune ka maikaʻi o ka amplification o ka primer.

Fig 8 Ka hopena a me ka puka ʻikepili

Kaʻina hana hoʻokolohua:
Nā koi o ka maikaʻi RNA:
Maʻemaʻe:1.7Hōʻike ka 2.0 i ke koena isothiocyanate.Pono ka ʻakika nucleic maʻemaʻe A260 / A230 ma kahi o 2 . Inā loaʻa kahi absorption ikaika ma 230 nm, e hōʻike ana aia nā pūhui kūlohelohe e like me nā ion phenate.Eia kekahi, hiki ke ʻike ʻia e 1.5% agarose gel electrophoresis.E kuhikuhi i ka māka, no ka mea, ʻaʻohe denaturation o ka ssRNA a ʻaʻohe pilina laina o ka logaritma kaumaha molekala, a ʻaʻole hiki ke hōʻike pololei ʻia ke kaumaha molekala.Kūlana: Theoreticallyʻaʻoleemi iho ma mua o 100ng/ul, inā haʻahaʻa loa ka hoʻomaʻemaʻe ʻana, ʻaʻole kiʻekiʻe ka maʻemaʻe

Fig9 RNA gel

Eia kekahi, inā he mea nui ka hāpana a he kiʻekiʻe ka manaʻo o ka RNA, ua ʻōlelo ʻia e aliquot iā ia ma hope o ka unuhi ʻana, a hoʻoheheʻe i ka RNA i ka hopena hope o 100-300ng / ul no ka hoʻohuli ʻana.Inke kaʻina hana o ka hoʻololi ʻana, i ka wā e paʻi ʻia ai ka mRNA, hoʻohana ʻia nā kumu mua oligo (dt) hiki ke hoʻopaʻa pono i nā huelo polyA no ka hoʻololi ʻana, ʻoiai ʻo lncRNA a me circRNA e hoʻohana i nā kumu hexamer random (Random 6 mer) no ka hoʻohuli ʻana i ka RNA holoʻokoʻa No ka miRNA, hoʻohana ʻia nā miRNA-specific neck-loop primers no ka hoʻololi ʻana.Nui nā ʻoihana i kēia manawa i hoʻokumu i nā pahu huʻu kūikawā.No ke ʻano kumu-loop, ʻoi aku ka maʻalahi o ke ʻano huelo, kiʻekiʻe-throughput, a me ka reagent-saving, akā ʻaʻole pono ka hopena o ka hoʻokaʻawale ʻana i nā miRNA o ka ʻohana hoʻokahi e like me ke ʻano kumu-loop.Loaʻa i kēlā me kēia pahu kope kope i nā koi no ka neʻe ʻana o nā kumu kumu kikoʻī kikoʻī (stem-loops).ʻO ka ʻōlelo kūloko i hoʻohana ʻia no ka miRNA ʻo U6.I ke kaʻina o ka hoʻohuli ʻana i ka pū, pono e hoʻohuli kaʻawale ʻia kahi paipu o U6, a pono e hoʻohui pololei ʻia nā kumu mua a hope o U6.Hiki i ka circRNA a me ka lncRNA ke hoʻohana i nā HKG ma ke ʻano he kuhikuhi kūloko.Inʻike cDNA,
inā ʻaʻohe pilikia me ka RNA, pono pū ka cDNA.Eia nō naʻe, inā e ʻimi ʻia ka maikaʻi o ka hoʻokolohua, ʻoi aku ka maikaʻi o ka hoʻohana ʻana i kahi gene reference internal (Reference gene, RG) hiki ke hoʻokaʻawale i ka gDNA mai nā cds.ʻO ka maʻamau, ʻo RG kahi gene mālama hale., HKG) e like me ka mea i hoikeia ma ke Kii 10;I kēlā manawa, hana wau i ka protein mālama soybean, a hoʻohana i ka actin7 i loko o nā introns ma ke ʻano he kuhikuhi kūloko.ʻO ka nui o ka ʻāpana i hoʻonui ʻia o kēia primer i ka gDNA he 452bp, a inā hoʻohana ʻia ka cDNA ma ke ʻano he template, ʻo ia ka 142bp.A laila ua ʻike ʻia nā hopena hoʻāʻo ʻo ka ʻāpana o ka cDNA ua hoʻohaumia maoli ʻia e ka gDNA, a ua hōʻoia pū ʻia ʻaʻohe pilikia me ka hopena o ka transcription hoʻohuli, a hiki ke hoʻohana ʻia ma ke ʻano he kumu no ka PCR.He mea pono ole ke holo pololei i ka electrophoresis gel agarose me cDNA, a he band diffuse ia, aole i maopopo.

Fig 10 ʻike cDNA

ʻO ka hoʻoholo ʻana i nā kūlana qPCRʻAʻohe pilikia e like me ka protocol o ka kit, ʻoi loa i ka pae o ka waiwai tm.Inā ʻaʻole i hoʻolālā maikaʻi ʻia kekahi mau primers i ka wā o ka hoʻolālā mua ʻana, e hopena i ka ʻokoʻa nui ma waena o ka waiwai tm a me ka theoretical 60 ° C, ua ʻōlelo ʻia e cDNA Ma hope o ka hui ʻana o nā laʻana, e holo i kahi PCR gradient me nā primers, a hoʻāʻo e pale i ka hoʻonohonoho ʻana i ka mahana me ka ʻole o nā kaula e like me ka waiwai TM.

ʻIkepili ʻikepili

ʻO ke kaʻina hana PCR maʻamau e pili ana i ka fluorescence quantitative e like me ka 2-ΔΔCT.ʻĀpana hoʻoponopono ʻikepili.

Nā huahana pili:

Maʻalahi PCR manawa maoli^TM –Taqman

Maʻalahi PCR manawa maoli^TM –SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix no ke kaula cDNA synthesis mua)

RT Easy II (Master Premix no ke kaula cDNA synthesis mua no qPCR)