1. E ʻike i ke komo ʻana o ka hoʻonā RNA
ʻO ka absorbance ma 280, 320, 230, a me 260 nm e hōʻike ana i nā waiwai o ka nucleic acid, ka hope (solution turbidity), ka paʻakai paʻakai, a me nā mea ola e like me ka protein, kēlā me kēia.E nānā maʻamau wale iā OD260/OD280 (Ratio, R).I ka 1.8 ~ 2.0, manaʻo mākou e hiki ke ʻae ʻia ka hoʻohaumia ʻana o ka protein a i ʻole nā mea ola ʻē aʻe i ka RNA, akā pono e hoʻomaopopo ʻia ke hoʻohana ʻia ʻo Tris ma ke ʻano he pale e ʻike ai i ka absorbance, ʻoi aku ka nui o ka waiwai R ma mua o 2 (ʻo ka mea maʻamau he <2.2).Ke ʻike ʻia ka R<1.8, ʻoi aku ka ʻike o ka haumia o ka protein a i ʻole nā mea ʻē aʻe i loko o ka hopena, a hiki ke hoʻoholo ʻia ka hopena o ka RNA e like me nā pono.Ke R>2.2, 'o ia ho'i, ua hydrolyzed 'o RNA i ho'okahi nucleic acid.
2. Electrophoric kumu o RNA
ʻO ka maʻamau, hoʻohana ʻia ka gel denaturing no RNA electrophoresis, akā inā no ka ʻike ʻana i ka maikaʻi o ka RNA, ʻaʻole pono ka denaturing gel, a hiki ke hoʻohana ʻia ka gel agarose maʻamau.ʻO ke kumu o ka electrophoresis ka ʻike ʻana i ka pono o nā kaula 28S a me 18S a me kā lākou ratio, a i ʻole ka pono o ka mRNA smear.ʻO ka mea maʻamau, inā ʻoi aku ka māmā o nā kaha 28S a me 18S (e pili ana i nā ʻaoʻao o nā kaula i maopopo), a ʻoi aku ka ʻoi o ka ʻōlinolino o 28S ma mua o ʻelua o ka hui 18S, manaʻo mākou he maikaʻi ka maikaʻi o ka RNA.
ʻO nā mea ma luna nei nā ʻano hana ʻelua a mākou e hoʻohana mau ai, akā ʻaʻole hiki i kekahi o kēia mau ala ʻelua ke haʻi maopopo iā mākou inā he koena RNase i ka hopena RNA.Inā he liʻiliʻi loa ka RNase i loko o ka hopena, paʻakikī iā mākou ke ʻike iā ia me ke ʻano o luna, akā ʻo ka hapa nui o nā hopena enzymatic hope e lawe ʻia ma luna o 37 degere a no ka manawa lōʻihi.Ma kēiaʻano, inā he liʻiliʻi loa ka RNase i ka hopena RNA, a laila e loaʻa kahi wahi kūpono a me ka manawa e pāʻani ai i kā lākou kuleana ma nā hoʻokolohua ma hope, aʻo ka hoʻokolohua e anu i kēia manawa.Ma lalo mākou e hoʻolauna i kahi ala e hiki ai ke hōʻoia inā he koena RNase i loko o ka hopena RNA.
3. Ho'āʻo mālama wela
E like me ka laʻana, e huki i ʻelua 1000 ng RNA mai ka RNA solution a hoʻohui iā ia i ka 0.5 ml centrifuge tube, a hoʻohui iā ia me ka pH 7.0 Tris buffer i ka huina o 10 ul, a laila e hoʻopaʻa i ka pāpale o ka paipu.E hoʻokomo i kekahi o ia mau mea i loko o kahi ʻauʻau wai wela mau ma 70°C a mālama i ka mahana no 1 hola.ʻO ka ʻāpana ʻē aʻe i mālama ʻia i loko o ka friji -20 ° C no 1 mau hola.Ke pau ka manawa, wehe i nā laʻana ʻelua no ka electrophoresis.Ma hope o ka pau ʻana o ka electrophoresis, e hoʻohālikelike i nā kaula electrophoretic o nā mea ʻelua.Inā kūpaʻa a ʻaʻohe ʻokoʻa koʻikoʻi o nā kaula o nā mea ʻelua (ʻoiaʻiʻo, ua kū pū kā lākou mau pūʻulu i nā kūlana ma ke ʻano 2), ʻo ia hoʻi ʻaʻohe koena RNase contamination i ka hopena RNA, a maikaʻi loa ka maikaʻi o ka RNA.ʻO ka mea ʻē aʻe, inā hōʻike ka hāpana i hoʻomoʻa ʻia ma 70 ° C e hōʻike ana i ka hoʻohaʻahaʻa ʻana, e hōʻike ana aia he RNase contamination i ka hopena RNA.
2 Nā ʻano hoʻokolohua a me nā ʻenehana no ka unuhi ʻana o RNA
ʻO nā pilikia a mākou e hālāwai pinepine ai i ka unuhi ʻana i ka RNA: (1) He haʻahaʻa ka hua RNA;(2) He haumia paʻakai ko RNA;(3) Loaʻa i ka RNA ka pollution solvent koʻikoʻi;(4) hōʻemi hōʻemi a me nā pilikia ʻē aʻe
1. Hoʻohana maʻamau ʻia nā mea hoʻoheheʻe RNA a pau
ʻO ke ʻano o ka guanidine isothiocyanate a me ke ʻano Trizol ka mea maʻamau i hoʻohana ʻia no ka unuhi ʻana o ka RNA a pau mai nā ʻiʻo holoholona a me nā ʻāpana holoholona.He kūpono loa ia no nā mea liʻiliʻi liʻiliʻi a me nā ʻiʻo i paʻakikī loa e unuhi, e like me ka unuhi ʻana o ka RNA āpau mai ka ʻili rabbit a me ka ʻiʻo pili holoholona;Eia kekahi, hiki ke hoʻohana ʻia ʻo Trizol, ma ke ʻano he lysis reagent maʻamau, no ka unuhi ʻana i nā ʻiʻo mea kanu, bacteria, fungi a me nā mea ʻē aʻe.No nā ʻiʻo mea kanu i loaʻa nā polysaccharides a me nā polyphenols, e like me ka camellia oleifera, lau kī, rapeseed, a me nā mea ʻē aʻe, hiki ke hoʻohana ʻia ke ʻano CTAB e unuhi i ka RNA a pau.
Ma ke ʻano maʻamau, kaulana loa ke ʻano kolamu pālua ma muli o kāna hana maʻamau maʻamau, ʻaʻohe pono e hoʻohui i ka RNase, a me ka palekana-ʻaʻohe chloroform, phenols a me nā mea hoʻokalakupua ʻē aʻe no ka unuhi.(nā huahana i ʻōlelo ʻia )
2. Ka unuhi ʻana o ka RNA a pau mai nā ʻiʻo holoholona
(1) E hoʻāʻo e koho i ka ʻiʻo hou, inā ʻaʻole hou (ʻoi aku ka maikaʻi i loko o ʻekolu mahina - 80 ℃ refrigerator a i ʻole ka hau i ka wai hau.
(2) E hoʻohana i nā ʻokiʻoki maʻemaʻe a me nā tweezers e ʻoki i kahi ʻāpana liʻiliʻi, e hoʻāʻo e ʻoki i ka ʻāpana waena o ka ʻiʻo i ka wā e ʻoki ai i ka hāpana, a i ʻole e ʻoki mua i ka ʻāpana nui mai ka waena, a laila e ʻoki i ka hāpana ma ke kūlana hou.Pono e hoʻopau pihaʻia kaʻiʻo i weheʻia, e hoʻokomo i kaʻiʻo i hoʻopiliʻia i loko o kahi paipu EP me ka RNaseʻole, e hoʻokomo i ka lysate, pono e hōʻike pono i ka lysate, a hoʻomākaukau no ka homogenization.
(3) No nā ʻiʻo maʻamau, koho i nā ʻiʻo ka nui o ka mung bean (30-60 mg) no ka homogenization.Inā loaʻa i nā ʻiʻo ka nui o ka protein, ka momona, a i ʻole nā ʻiʻo fibrous paʻa e like me ke ake, e hoʻonui a hoʻemi paha i ka nui o nā ʻiʻo i ʻoki ʻia (koho) E koho i ka 10~20 mg).
(4) Inā unuhi ʻia ka ʻiʻo iʻa, ka ʻiʻo ʻōpae, ka iʻa a me nā ʻiʻo ʻē aʻe me ka nui o ka wai, pono e hoʻonui ʻia ka nui o ka laʻana (manaʻo ʻia 100-200 mg).
(5) Ināʻae nā kūlana, hiki ke unuhi pololeiʻia kaʻiʻo holoholona ma hope o ka hoʻohuiʻiaʻana me kahi homogenizer tissue kiʻekiʻe, ināʻaʻohe mea like.
(6) Pono e kau koke ʻia ka RNA i loaʻa ma hope o ka unuhi ʻana i ka pahu hau e hōʻemi i ka hōʻino ʻana o RNA.
3. Helu holoholona RNA unuhi
(1) Nā pūnaewele hoʻokuʻu: centrifuge pololei a hoʻolei i ke kikowaena, holoi me ka PBS sterile no nā manawa 1-2, a laila hoʻokuʻu me ka nui kūpono o PBS, a laila hoʻohui i ka lysate no ka lysis.Mai hoʻohui pololei i ka lysate i nā cell precipitated ma hope o ka hoʻolei ʻana i ka wai.ʻO kēia ka mea e hoʻokuʻu ʻia ai ka pūʻolo histone ma hope o ka pili ʻana o nā cell lysed ma ka papa waho i waho o nā cell precipitated, a laila e kaupalena ʻia ka pili ʻana o nā cell i loko o ka pellet me ka lysate., ka hopena i ka lysis cell incomplete a me ka hoʻemi ʻana i ka hua RNA.
(2) ʻO nā kelepona i pili pono ʻole a i ʻole paʻa paʻa: Ma hope o ka hoʻolei ʻia ʻana o ke kikowaena, holoi me ka PBS no 1-2 mau manawa, a laila e hoʻopili pololei i ka nui kūpono o ka PBS a puhi i ka pā moʻomeheu me ka pipette a i ʻole ka pū e puhi ai i nā cell, a hoʻololi iā lākou i nā cell RNA-free.E hoʻohui i ka lysate i ka paipu EP o ka enzyme no ka unuhi ʻana.
(3) ʻO nā pūnaewele pili: pono e ʻeli ʻia me ka trypsin ma mua, a laila e hōʻiliʻili ʻia i loko o nā paipu EP RNase-free, centrifuged e wehe i ka supernatant, holoi ʻia 1-2 mau manawa me ka PBS e wehe i ka trypsin keu, a hoʻopaneʻe ʻia me ka nui kūpono o PBS A laila e hoʻomau i ke kaʻina unuhi.
4. Mea kanu RNA unuhi
Nui nā ʻiʻo mea kanu i nā pūhui phenolic, a i ʻole nā polysaccharides, a i ʻole kekahi mau metabolites lua i ʻike ʻole ʻia, a i ʻole he hana kiʻekiʻe o RNase.Hoʻopili paʻa ʻia kēia mau mea me RNA ma hope o ka lysis cell e hana i nā paʻakikī insoluble a i ʻole colloidal precipitates, he mea paʻakikī ke wehe.No laila, ke unuhi mākou i nā mea kanu, pono mākou e koho i kahi pahu no nā mea kanu.Hiki i ka lysate i loko o ka pahu ke hoʻoponopono maikaʻi i nā pilikia o ka oxidation maʻalahi o nā polyphenols a me ka hoʻokaʻawale ʻana o nā pūhui polysaccharide a me nā waikawa nucleic.
(No ka polysaccharide polyphenol plant RNA extraction, nā huahana i ʻōlelo ʻia:
(1) Pono ka ʻili, ka pulp, nā ʻanoʻano, nā lau, a me nā mea ʻē aʻe o ka mea kanu i loko o kahi mortar.I ka wā o ka wili ʻana, pono e hoʻopiha ʻia ka nitrogen wai i ka manawa e pale ai i ka hoʻoheheʻe ʻana i ka hāpana.Pono e hoʻohui koke ʻia ka laʻana honua i ka lysate a hoʻoluliluli ʻia e pale aku i ka hōʻino ʻana o RNA.
(2) No ka nui o ka fiber e like me ka laiki a me ka lau palaoa, pono e hoemi pono ia ka nui o ka unuhi, a i ole ia, aole e pau ka wili ana a me ka lysis, me ka hopena o ka RNA i unuhiia.
(3) No nā ʻiʻo mea kanu me ka nui o ka wai, e like me ka hua pomegerane, hua melika, hua peach, a me nā mea ʻē aʻe, pono e hoʻonui ʻia ka nui o ka hāpana (100-200 mg ke koho).
(4) ʻO nā ʻiʻo mea kanu, e like me nā lau mea kanu, nā rhizomes, nā hua paʻakikī a me nā mea ʻē aʻe e paipai ʻia e hoʻohana i ka nitrogen wai e hoʻomoʻa pono i nā mea i loko o ka mortar, a laila hoʻomau i ka hana unuhi.ʻAʻole maikaʻi paha nā mea homogenizer maʻamau i ka homogenizing i nā ʻiʻo mea kanu, a ʻaʻole ʻōlelo ʻia.
5. Nā mea e mālama ai no ka unuhi ʻana o RNA
(1) Pono e hoʻomaʻamaʻa ʻia nā laʻana o ka ʻili i mea e pale aku ai i ka maloʻo a me ka hau.
(2) Pono ka ʻiʻo e hoʻopaʻa piha ʻia i ka wā o ka unuhi ʻana, a ʻaʻole e liʻiliʻi ka nui o ka ʻiʻo, ʻaʻole i ʻoi aku ka nui.
(3) Pono e hāʻawi ʻia ka manawa incubation ma hope o ka hoʻohui ʻana i ka lysate e lyse piha i ka hāpana.
(4) I ka hoʻohana ʻana i ke ʻano Trizol no ka unuhi ʻana, ʻo ke kumumanaʻo o ka hoʻomoʻa ʻana i ka supernatant ma hope o ka stratification ʻo ia ka "makemake e inhale liʻiliʻi ma mua o ka inhale hou aʻe", a ʻaʻole pono e unuhi i ka papa waena, i ʻole e hoʻopilikia ʻia ka genomic DNA contamination.
(5) I ka wā e holoi ai, pono e komo piha ka wai holoi a puni ka paia o ka paipu i mea e holoi pono ai.
(6) No ke ʻano o ka ʻoki ʻana i ke kolamu, ma waho aʻe o ka wehe ʻana i ke kolamu ma hope o ka holoi ʻana, pono e waiho ʻia ke kolamu adsorption i loko o kahi papa hoʻomaʻemaʻe ultra-maʻemaʻe a puhi ʻia no 5-10 mau minuke e hoʻopau piha i ka solvent organik i ka maloʻo.
(7) Ma ka elution hope loa o ke ʻano kolamu, ma hope o ka hoʻohui ʻana i ka wai DEPC, pono e hoʻopili ʻia no 3-5 mau minuke, a i ʻole e hoʻomehana ʻia ka wai DEPC i 60 ° C ma mua e hoʻonui ai i ka hua elution.Ma ke ʻano kuʻuna Trizol cleavage a me ka isopropanol precipitation method, ua hoʻoheheʻe ʻia ka RNA hope i ka wai DEPC, no laila pono e hāʻawi ʻia kahi manawa kūpono no ka hoʻoheheʻe ʻana, a pono e puhi mau ʻia ka lalo o ka paipu centrifuge me ka piko pipette.
3 Tʻekolu Nā kumu a me nā hoʻonā no ka haʻahaʻa haʻahaʻa RNA / maikaʻi ʻole
1. He haʻahaʻa loa ka hua
He haʻahaʻa loa ka hāpana i unuhi ʻia, ʻaʻole lawa ka nui o ka huina, a ʻoi aku ka nui o ka hāpana i unuhi ʻia a ʻaʻole i pau ka lysis;pono e hoʻohana ʻia ka ʻiʻo a i ʻole nā pūnaewele o ka maikaʻi kūpono no ka unuhi ʻana, pono e hana maikaʻi ʻia ka hana mua o ka hāpana, a lawa ka lysis.
2. Ke koena genome
I ka unuhi ʻana ma ke ʻano Trizol, i ka wā e omo ai ka supernatant i ka papa waena ma hope o ka waiho ʻana, e hoʻopilikia ʻia ka genome koʻikoʻi;pono e mālama pono i ka wā e waiho ana i mea e pale ai i ka omo ʻana i ka papa waena.Inā hoʻohana ʻia ke ʻano kolamu no ka unuhi ʻana, hiki ke koho ʻia kahi pahu me DNase I no ka unuhi ʻana.Hoʻopili pololei ʻia ka nucleic acid i hoʻopili ʻia ma ka membrane me DNase I, hiki ke hōʻemi nui i nā koena DNA.
3. Hoʻohaʻahaʻa RNA
ʻO ka hoʻohaʻahaʻa paha ia o ka laʻana i unuhi ʻia iho, a i ʻole ka hōʻino ʻia i ka wā o ke kaʻina hana unuhi;e like me ka mea hiki, pono e hoʻohana i nā laʻana hou no ka unuhi ʻana i ka RNA, a pono e mālama ʻia nā laʻana i hōʻiliʻili ʻia i loko o ka wai hau a i ʻole -80 ° C i ka manawa, a pono e pale ʻia i ka maloʻo a me ka hoʻoheheʻe ʻana.Pono e hoʻohana ʻia nā ʻōlelo aʻoaʻo manuahi ʻo RNase/DNase, centrifuge tubes a me nā mea ʻē aʻe i ke kaʻina hana unuhi RNA.ʻO ke kaʻina hana unuhi e like me ka wikiwiki.Pono e kau ʻia ka RNA i unuhi ʻia ma kahi pahu hau a mālama ʻia ma -80 i ka manawa.Inā pono e ʻike ʻia ka RNA i unuhi ʻia e ka gel electrophoresis, pono e hana ʻia ka electrophoresis ma hope koke o ka unuhi ʻana, a pono e hoʻololi ʻia ka pale electrophoresis me kahi mea hou i hoʻomākaukau ʻia.
4. Paʻakai a me nā koena solvent organik
Aia nā pa'akai phenol a me guanidine i loko o nā mea ho'ohehe'e, a aia i loko o ka wai holoi ka ethanol.I ka wā o ka unuhi ʻana, ʻaʻole i hoʻopau piha ʻia ka lysate a hoʻolei ʻia, ʻaʻole i maloʻo loa ka wai holoi.ʻO nā paʻakai koena a me nā mea hoʻoheheʻe organik he mea pōʻino i ka transcription hope a me PCR.ʻO nā degere like ʻole o ka inhibition, no laila pono e hoʻopau piha ʻia ka lysate kiko i ka wā o ke kaʻina hana unuhi, a lawa ka holoi ʻana i hiki ke holoi ʻia nā paia a puni o ka paipu.Eia kekahi, hoʻokaʻawale ʻia ka paipu a puhi ʻia kahi hana kūpono, e hōʻemi hou i ke koena o nā mea organik.
No ka ʻike hou aku e pili ana i ka unuhi ʻana o RNA, e ʻoluʻolu e hahai i kā mākou pūnaewele:
www.foreivd.com no ka 'ike hou aku.
Ka manawa hoʻouna: Dec-01-2022
