1. Hoomaopopo mua

I kēia pae, pono mākou e hoʻomaopopo i kekahi mau manaʻo a me nā huaʻōlelo, i pale aku ai i ka hana hewa ʻana i mua o ko mākou poʻe ʻelemakule, e like me:

Nīnau: He aha ka ʻokoʻa ma waena o RT-PCR, qPCR, PCR manawa maoli, a me RT-PCR manawa maoli?

Pane: ʻO RT-PCR ka hoʻololi ʻana i ka PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR), he ʻano ʻano hoʻohana nui ʻia o ka hopena kaulahao polymerase (PCR).I loko o RT-PCR, ua hoʻohuli ʻia kahi kaula RNA i ka DNA hoʻohui, a laila hoʻohana ʻia ma ke ʻano he kumu hoʻohālike no ka hoʻonui ʻana i ka DNA e PCR.
ʻO ka manawa maoli-PCR a me qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) ʻo ia ka mea like, ʻo lāua ʻelua he PCR quantitative manawa maoli, ʻo ia hoʻi, ʻo kēlā me kēia pōʻai o PCR he mau moʻolelo ʻikepili manawa maoli, no laila hiki ke hoʻoponopono pololei ʻia ka helu o nā kumu hoʻomaka.

ʻOiai ʻo ka PCR Real-time (real-time fluorescent quantitative PCR) a me Reverse transcription PCR (reverse transcription PCR) me he mea lā ua hoʻopau ʻia ʻo RT-PCR, ʻo ka hui honua: RT-PCR kikoʻī e pili ana i ka hoʻohuli ʻana i ke kope.PCR , ʻO ka PCR manawa maoli ka mea maʻamau i hoʻopau ʻia e like me qPCR (quantitative real-time PCR).

A ʻo RT-PCR manawa maoli (RT-qPCR), ʻo ia ka PCR transcription hope i hui pū ʻia me ka ʻenehana quantitative fluorescent.: e kiʻi mua i ka cDNA (RT) mai ka RNA reverse transcription, a laila e hoʻohana i ka PCR Real-time no ka anana quantitative (qPCR).ʻO ka hapa nui o nā laboratories e hana RT-qPCR, ʻo ia hoʻi, ka noiʻi ʻana i ka ʻōlelo RNA down-regulation, no laila ʻo ka qPCR e kamaʻilio ʻia e nā mea a pau i loko o ke keʻena hana e pili ana i RT-qPCR, akā mai poina i ka nui o nā hoʻokolohua DNA i nā noi lapaʻau.Ka helu helu, e like me ka maʻi hepatitis B HBV ʻike.

Nīnau: Ma hope o ka heluhelu ʻana i ka PCR quantitative fluorescent, no ke aha e hoʻomalu ʻia ai ka ʻāpana i hoʻonui ʻia i loko o ka laulā o 80-300bp?

Pane: He ʻokoʻa ka lōʻihi o kēlā me kēia kaʻina gene, he mau kb kekahi, he mau haneli bp kekahi, akā pono mākou e koi i ka lōʻihi o ka huahana he 80-300bp i ka wā e hoʻolālā ai i nā primers, pōkole a lōʻihi paha ʻaʻole kūpono no ka ʻike PCR fluorescent quantitative.He pōkole loa ka ʻāpana huahana e ʻike ʻia mai ka primer-dimer.ʻO ka lōʻihi o ka primer-dimer ma kahi o 30-40bp, a he paʻakikī ke hoʻokaʻawale inā he primer-dimer a i ʻole he huahana inā ʻoi aku ka liʻiliʻi ma mua o 80bp.Inā lōʻihi loa ka ʻāpana huahana, ʻoi aku ma mua o 300bp, e alakaʻi maʻalahi ia i ka hana haʻahaʻa haʻahaʻa a ʻaʻole hiki ke ʻike pono i ka nui o ka gene.

No ka laʻana, ke helu ʻoe i ka nui o ka poʻe i loko o ka lumi papa, pono ʻoe e helu i ka nui o nā waha.Pēlā nō ke ʻike ʻoe i nā genes, pono wale ʻoe e ʻike i kahi kaʻina o kahi gene e hōʻike ai E hana ke kaʻina holoʻokoʻa.Inā makemake ʻoe e helu i nā kānaka, pono ʻoe e helu i nā waha a me nā ihu, nā pepeiao, a me nā aniani, a maʻalahi ke hana hewa.

No ka hoʻonui ʻana, i ka noiʻi biological, nui nā hihia noiʻi mai kēlā me kēia wahi, no ka mea he lōʻihi loa ke kaʻina gene o kēlā me kēia ʻano, ʻaʻole pono a hiki ʻole ke ana i nā ʻāpana āpau, e like me ka bacterial 16S sequencing, ʻo ia hoʻi ka hoʻokō ʻana i ke kaʻina conservative o ka bacteria Assays e infer i ka helu o kekahi heluna o ka bacteria.

Nīnau: He aha ka lōʻihi kūpono no ka hoʻolālā kumu qPCR?

Pane: Ma ka ʻōlelo maʻamau, ʻo ka lōʻihi o ka primer ma kahi o 20-24bp, ʻoi aku ka maikaʻi.ʻOiaʻiʻo, pono mākou e hoʻolohe i ka waiwai TM o ka primer i ka wā e hoʻolālā ai i ka primer, no ka mea pili kēia i ka mahana annealing maikaʻi loa.Ma hope o ka nui o nā hoʻokolohua, ua hōʻike ʻia ʻo 60 ° C kahi waiwai TM ʻoi aku ka maikaʻi.Inā haʻahaʻa loa ka mahana annealing, e alakaʻi maʻalahi ia i ka hoʻonui ʻole.Inā kiʻekiʻe ka wela o ka annealing, e haʻahaʻa loa ka hoʻonui ʻana, e hoʻomaka ka piko o ka pihi hoʻonui ma hope, a e hoʻopaneʻe ʻia ka waiwai CT.

Nīnau: Pehea ka ʻokoʻa o ke ʻano kala me ke ʻano probe?

Pane: ʻO ke ʻano o ke kalaʻAʻole hoʻokuʻu ʻia kekahi mau mea hoʻonani fluorescent, e like me SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, a me nā mea ʻē aʻe.No laila, i ka hoʻomaka ʻana o ka hopena PCR, ʻaʻole hiki i ka mīkini ke ʻike i ka hōʻailona fluorescent.Ke hiki aku ka hopena i ka pae annealing-extension, wehe ʻia ke kaula pālua, a hoʻohui ʻia kahi kaula hou ma lalo o ka hana a DNA polymerase, a hoʻopaʻa ʻia ka mole fluorescent i ke awāwa liʻiliʻi dsDNA.Ke piʻi aʻe nei ka nui o nā pōʻai PCR, ua hui pū ʻia ka nui a me ka nui o nā mea pena me ka DNA stranded pālua, a hoʻonui mau ʻia ka hōʻailona fluorescent.Hoʻohana nui ʻia ke ʻano kala i ka noiʻi ʻepekema.
PS: E akahele i ka hana ʻana i ka hoʻokolohua, pono e hoʻohui ʻia ke kala me ka DNA kanaka, e makaʻala e hoʻololi i ke kanaka fluorescent.

ʻAno wai (hema) ʻano noiʻi ('ākau)
PS: E akahele i ka hana ʻana i ka hoʻokolohua, pono e hoʻohui ʻia ke kala me ka DNA kanaka, e makaʻala e hoʻololi i ke kanaka fluorescent.

Hoʻopili ʻo SYBR Green Ⅰ i ke awāwa liʻiliʻi o DNA

ʻO ke ala ʻimiʻO Taqman probe ka mea hoʻohana maʻamau hydrolysis probe.Aia kekahi pūʻulu fluorescent ma ka hopena 5' o ka probe, maʻamau FAM, a ʻo ka probe ponoʻī he kaʻina hoʻohui i ka gene i koho ʻia.Aia kekahi pūʻulu hoʻopiʻi fluorescent ma ka hopena 3'.E like me ke kumu o ka fluorescence resonance indonance inding transonnence (freters flireescent molle (7-10NM ʻaeʻia ka moleleNo laila, i ka hoʻomaka ʻana o ka hopena PCR, i ka wā e manuahi a paʻa ka probe i loko o ka ʻōnaehana, ʻaʻole e hoʻokuʻu ka fluorescent pūʻulu nūhou.Ke hoʻopili ʻia, hoʻopaʻa ka primer a me ka probe i ka template.I ka wā hoʻonui, hoʻomau ka polymerase i nā kaulahao hou.He 5′-3′ ka hana exonuclease ka DNA polymerase.Ke hiki aku i ka probe, e hydrolyze ka DNA polymerase i ka probe mai ka la'ana, e ho'oka'awale i ka hui fluorescent reporter mai ka hui fluorescent quencher, a e hoʻokuʻu i ka hōʻailona fluorescent.No ka mea aia ka pilina hoʻokahi ma waena o ka probe a me ka template, ʻoi aku ka maikaʻi o ke ʻano probe ma mua o ke ʻano dye ma ke ʻano o ka pololei a me ka naʻau o ka hoʻāʻo.Hoʻohana nui ʻia ke ʻano probe i ka hōʻoia.

Q: He aha ka quantification piha?He aha ka Relative Quantification?

Pane: ʻO ka helu ʻana i ka helu ʻana o ka helu kope mua o ka laʻana e hoʻāʻo ʻia e qPCR, e like me ka nui o nā maʻi HBV i loko o 1ml o ke koko.ʻO ka hopena i loaʻa ma ka hoʻohālikelike pili ʻana, ʻo ia ka hoʻololi ʻana i ka nui o ka gene i hoʻopaʻa ʻia i loko o kahi laʻana kikoʻī e pili ana i kahi laʻana kuhikuhi ʻē aʻe, a ua hoʻoponopono ʻia ka hōʻike gene.

Nīnau: E pili ana anei ka nui o ka unuhi ʻana i ka RNA, ka hoʻohuli ʻana i ka pono kope, a me ka hoʻonui ʻana i nā hopena hoʻokolohua?
Nīnau: E hoʻopili anei nā mea hoʻoheheʻe hoʻoheheʻe, nā mea hoʻihoʻi hou, a me nā mea hoʻouna māmā i nā hopena hoʻokolohua?
Nīnau: He aha ke ala e hiki ai ke hoʻoponopono i ka ʻikepili hoʻokolohua?

E pili ana i kēia mau pilikia, e wehewehe mākou iā lākou i nā kikoʻī ma nā ʻāpana kiʻekiʻe a kiʻekiʻe ma lalo nei.
2. ʻIke holomua

E pili ana i ka PCR quantitative fluorescent manawa maoli, pono mākou e ʻike i ka ʻoiaʻiʻo o ka paʻi ʻia ʻana o nā kaukani o nā pepa noiʻi ʻepekema i kēlā me kēia makahiki, ʻaʻole he helu liʻiliʻi ka ʻenehana PCR fluorescent quantitative.

Inā ʻaʻohe maʻamau maʻamau e ana i ka hoʻokolohua PCR fluorescent quantitative, ʻokoʻa paha nā hopena.No ka genea like o ka ano like, me ke kaina hana like, e like ole ana ka hopena o ka ike, a he mea paakiki no ka poe hope e hana hou i na hopena like.ʻAʻole ʻoe ʻike i ka mea pono a me ka hewa.

ʻO kēia ke ʻano o ka fluorescent quantitative PCR he ʻenehana hoʻopunipuni a i ʻole kahi ʻenehana hilinaʻi ʻole?ʻAʻole, no ka mea ʻoi aku ka maʻalahi o ka PCR quantitative fluorescent a ʻoi aku ka pololei, a ʻo ka hana hewa iki e hoʻopuka i nā hopena kū'ē loa.ʻO kahi poho liʻiliʻi he tausani mile ka mamao.Hiki ke hoʻomāinoino pinepine ʻia ka mea kākau o ka ʻatikala e ka poʻe loiloi.Ma ka manawa like, paʻakikī hoʻi ka poʻe loiloi o ka puke pai e koho mai nā hopena hoʻokolohua like ʻole.

ʻO nā mea āpau, e kuhikuhi ana i ka nele o ka ʻae ʻana i nā hoʻokolohua PCR manawa maoli.I kēia hopena, ua hoʻomaka ka poʻe ʻepekema kahiko i ka ʻoihana e hoʻokumu i nā kūlana,e koi ana i nā mea kōkua e hāʻawi i kekahi mau kikoʻī hoʻokolohua a me ka hoʻoili ʻikepili pono (me ka ʻikepili pono) i loko o ka ʻatikala e hoʻokō i kēia mau kūlana.

Hiki i nā mea nānā ke hoʻoholo i ka maikaʻi o ka hoʻokolohua ma ka heluhelu ʻana i kēia mau kikoʻī;Hiki i nā mea heluhelu e hiki mai ana ke hoʻohana i kēia e hana hou i ka hoʻokolohua a hoʻomaikaʻi paha i ka hoʻokolohua.A laila ua piha nā hopena hoʻokolohua i loaʻa i kēia ala i ka ʻike, kiʻekiʻe kiʻekiʻe, a hiki ke hoʻohana.

MIBBI (Ka ʻike liʻiliʻi loa no ka noiʻi ʻana i ke ola kino a me ka biomedical -http://www.mibbi.org) hiki mai.ʻO MIBBI kahi papahana e hāʻawi ana i nā kūlana no nā hoʻokolohua.Ua paʻi ʻia ma ke ʻano.Kuhi ʻia kēia papahana i nā ʻano hoʻokolohua olaola like ʻole, me ka biology cell, Microarray, qPCR a mākou e kūkākūkā nei i kēia manawa, a me nā mea ʻē aʻe, a hāʻawi i kēlā me kēia ʻano hoʻokolohua i ka wā e hoʻouna ai i nā manuscript.Pono e hāʻawi ʻia kēlā ʻike i nā manawa a pau.

Ma ka papahana MIBBI, ʻelua ʻatikala e pili ana i ka PCR quantitative fluorescent, ʻo ia hoʻi:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – he ʻōlelo i hoʻonohonoho ʻia a me ke alakaʻi hōʻike no ka ʻikepili helu PCR manawa maoli;
·MIQE (Nā ʻike liʻiliʻi no ka hoʻolaha ʻana i nā hoʻokolohua PCR mau manawa maoli) - ʻike liʻiliʻi no ka hoʻopuka ʻana i nā ʻatikala e pili ana i nā hoʻokolohua PCR quantitative manawa maoli.
ʻO ka mea mua, e kamaʻilio e pili ana iā RDML, ka ʻōlelo kikoʻī.

Ināʻaʻohe ho'ākāka maʻamau no nā mea a pau, hikiʻole ke hoʻomau i ka kūkākūkāʻana,ʻo ia ke kumu i koʻikoʻi ai ka weheweheʻana i nā hua'ōlelo i ka hoʻokolokolo.
ʻO nā huaʻōlelo i hoʻohana ʻia i ka hoʻokolohua PCR fluorescent quantitative e pili ana i kēia ʻike.Ua hana ʻo QIAGEN i ka hōʻuluʻulu maikaʻi loa no mākou.Ua maloʻo nā mea i lalowaiwai .

ʻĀpana hoʻonui
ʻO ka pihi hoʻonui e pili ana i ka pihi i hana ʻia i ka wā o ke kaʻina PCR, me ka helu pōʻaiapuni e like me ka abscissa a me ka ikaika o ka fluorescence manawa maoli i ka wā o ka hopena ma ke ʻano he ordinate.

Pono e loaʻa nā hiʻohiʻona ma hope o ka pihi hoʻonui maikaʻi: he palahalaha a emi iki paha ka papa kuhikuhi, a aole ikeia ke ano pii;ua akaka ke kiko inflection o ka piko, a ua like ka slope o ka mahele exponential i ka pono amplification.ʻO ka nui o ka slope, ʻoi aku ka kiʻekiʻe o ka hoʻonui ʻana;ka pōʻai hoʻonui holoʻokoʻa He maikaʻi ka parallelism, e hōʻike ana i ka hoʻonui ʻana i ka pono o kēlā me kēia paipu;ʻike ʻia ka māhele exponential o ka pihi hoʻonui o nā laʻana haʻahaʻa.

Kumukumu (kumu kumu)
ʻO ka pae kumu ka pae walaʻau o ka pōʻai mua, ana maʻamau ma waena o ka 3rd a me ka 15th pōʻai, no ka mea, ʻaʻole hiki ke ʻike ʻia ka piʻi ʻana o ka waiwai fluorescence ma muli o ka huahana amplification i kēia manawa.Hiki ke hoʻololi ʻia ka helu o nā pōʻaiapuni i hoʻohana ʻia no ka helu ʻana i ka pae kumu a pono paha e hoʻemi ʻia inā hoʻohana ʻia nā helu maʻamau kiʻekiʻe a i ʻole ke kiʻekiʻe o ka pae haʻiʻōlelo o ka gene i manaʻo ʻia.

Pono ka hoʻonohonoho ʻana i ka papa kuhikuhi e nānā i ka ʻikepili fluorescence mai ka pihi hoʻonui linearity.Hoʻonohonoho ʻia ka papa kuhikuhi i mea e hoʻomaka ai ka ulu ʻana o ka pihi hoʻonui me kahi helu pōʻaiapuni i ʻoi aku ka nui ma mua o ka helu pōʻaiapuni kumu.Pono e hoʻonohonoho pakahi ʻia nā papa kuhikuhi no kēlā me kēia kaʻina pahuhopu.Pono e unuhi ʻia nā waiwai fluorescence awelika i ʻike ʻia i nā pōʻai mua mai nā waiwai fluorescence i loaʻa i nā huahana i hoʻonui ʻia.ʻO nā mana hou loa o nā polokalamu PCR Real-Time e ʻae i ka loiloi maʻalahi o nā hoʻonohonoho baseline no nā laʻana pākahi.

I loko o nā pōʻai mua o ka hopena hoʻonui PCR, ʻaʻole loli nui ka hōʻailona fluorescence.ʻO ka hoʻokokoke ʻana i kahi laina pololei i kapa ʻia ʻo ka baseline, akā inā mākou e nānā pono i nā pōʻai mua, ʻike mākou aia i loko o ka baseline ka mea e hana nei ma ke kiʻi ma lalo nei.

ʻO ka Background Background e pili ana i
ka waiwai fluorescence kikoʻī ʻole i ka pane.No ka laʻana: ʻaʻohe pono o ka fluorescence quenching;a i ʻole he helu nui o nā ʻano hoʻohālike DNA pālua ma muli o ka hoʻohana ʻana iā SYBR Green.Hoʻopau makemakika nā ʻāpana hope o ka hōʻailona e ka Real-Time PCR software algorithm.

Hōʻailona hōʻailona
ʻO ka hōʻailona hōʻailona e pili ana i ka hōʻailona fluorescent i hana ʻia e SYBR Green a i ʻole nā ​​​​mea hoʻopaʻa inoa fluorescently sequence-specific probes i ka wā Real-Time PCR.

Hōʻailona hōʻike hōʻike maʻamau (RN)
ʻO ka RN e pili ana i ka ikaika o ka fluorescence o ka mea hoʻoheheʻe reporter i puʻunaue ʻia me ka ikaika o ka fluorescence o ka wai hoʻohālikelike passive i ana ʻia i kēlā me kēia pōʻai.

Peila Hoʻohālua
I kekahi mau PCR Real-Time,ua hoʻohana ʻia ka waikani fluorescent ROX ma ke ʻano he kuhikuhi kūloko e hoʻomaʻamaʻa i ka hōʻailona fluorescent.Hoʻoponopono ia no nā ʻano like ʻole ma muli o ka paipu pololei ʻole, kūlana maikaʻi, a me ka fluorescence fluctuations ma ke kumu punawai.

ʻO ka paepae fluorescence (threshold)
ua hoʻoponopono ʻia ma luna o ka waiwai kāʻei kua a ma lalo o ka waiwai pāpū o ka pihi hoʻonui.Pono ia e moe ma ka ʻāpana laina o ka pihi hoʻonui, e hōʻike ana i ka laulā log-linear o ka ʻike PCR.Pono e hoʻonoho ʻia nā paepae ma ka nānā ʻana i ka pihi log-amplification i hiki ke ʻike maʻalahi i ka pae log-linear o PCR.Inā nui nā genes i hoʻopaʻa ʻia ma Real-Time PCR, pono e hoʻonoho ʻia ka paepae no kēlā me kēia pahu hopu.ʻO ka mea maʻamau, hoʻohana ʻia ka hōʻailona fluorescence o nā pōʻai mua 15 o ka hopena PCR e like me ka hōʻailona fluorescence background, a ʻo ka paepae fluorescence he 10 mau manawa i ka ʻokoʻa maʻamau o ka hōʻailona fluorescence o ka mua 3 a hiki i 15 mau pōʻai PCR, a ua hoʻonohonoho ʻia ka paepae fluorescence i ka manawa exponential o PCR amplification.Ma keʻano laulā, loaʻa i kēlā me kēia mea hana kona paepae fluorescence ma mua o ka hoʻohana ʻana.

Ka paepae pōʻaiapuni (CT) a i ʻole ka pae kea (CP)
ʻO ka pōʻaiapuni kahi e ʻoi ai ka pihi hoʻonui i ka paepae (ʻo ia hoʻi, ke kiko e piʻi nui ai ka ʻike fluorescence).Hiki ke helu ʻia ʻo CT a hiki ke helu ʻia ka nui o ka template hoʻomaka.Hōʻike ka waiwai CT i ka helu o nā pōʻai i ʻike ʻia i ka wā e hiki ai ka hōʻailona fluorescent i kēlā me kēia paipu hoʻonā PCR i ka paepae i hoʻonohonoho ʻia.Aia ka pilina laina ma waena o ka waiwai CT o kēlā me kēia la'ana a me ka logarithm o ka helu kope mua o ka la'ana.ʻoi aku ka kiʻekiʻe o ka helu kope mua, ʻoi aku ka liʻiliʻi o ka waiwai CT, a me ka hope.Hiki ke hana ʻia kahi ʻōkuhi maʻamau ma ka hoʻohana ʻana i kahi maʻamau me ka helu kope mua i ʻike ʻia, kahi e hōʻike ai ka abscissa i ka waiwai CT, a ʻo ka ordinate e hōʻike ana i ka logarithm o ka helu kope mua.No laila, e like me ka loaʻa ʻana o ka waiwai CT o ka hāpana ʻike ʻole, hiki ke helu ʻia ka helu kope mua o ka hāpana mai ka pihi maʻamau.

ΔCT waiwai
Hōʻike ka waiwai ΔCTka ʻokoʻa ma waena o ka gene i hoʻopaʻa ʻia a me ka waiwai o ka gene reference endogenous CT, e like me ka gene keeping house, a hoʻohana ʻia e hoʻomaʻamaʻa i ka nui o ka template i hoʻohana ʻia:
⇒ΔCT = CT (hua hoʻopaʻa) – CT (gene hoʻohālikelike endogenous)

ΔΔCT Waiwai
Hōʻike ka waiwai ΔΔCT i ka ʻokoʻa ma waena o ka waiwai ΔΔCT mean o kahi laʻana o ka hoihoi (e laʻa, nā cell i hoʻoulu ʻia) a me ka waiwai ΔΔCT mean o kahi hāpana kuhikuhi (e laʻa, nā cell unstimulated).Ua kapa ʻia ka laʻana kuhikuhi ʻo ka calibration sample a ua hoʻohālikelike ʻia nā mea ʻē aʻe āpau i kēia no ka helu pili.
⇒ΔΔCT = awelika ΔCT (kahi laʻana o ka hoihoi) - awelika ΔCT (mea hoʻohālikelike)

Nā genes reference genes (genes reference genes)
ʻAʻole ʻokoʻa nā pae ʻōlelo o nā genes reference endogenous, e like me nā genes mālama hale (housekeeping genes), ma waena o nā laʻana.ʻO ka hoʻohālikelike ʻana i nā koina CT o ka gene reference i ka gene i hoʻopaʻa ʻia e hiki ke hoʻohālikelike ʻia ka pae hōʻike o ka gene i hoʻopaʻa ʻia i ka nui o ka RNA hoʻokomo a i ʻole cDNA (e nānā i ka ʻāpana ma nā koina ΔCT ma luna).

Pono nā genes kuhikuhi kūloko nohiki i ka RNA degradation a i ʻole ka hele ʻana o nā enzyme inhibitors i nā laʻana RNA, a me nā ʻano like ʻole o ka maʻiʻo RNA, ka hoʻohuli ʻana i ka maikaʻi o ka unuhi ʻana, ka hoʻihoʻi ʻana i ka waika nucleic, a me ka lawelawe ʻana i ka laʻana.No ke koho ʻana i ka gene (mau) kuhikuhi maikaʻi loa, ua hoʻololi mākou i ka algorithm e ʻae i kāna koho ʻana i ka ʻōlelo kuhikuhi maikaʻi loa e pili ana i ka hoʻonohonoho hoʻokolohua.

Ka hooponopono kuloko
He kaʻina hoʻomalu i hoʻonui ʻia i ka hopena like me ke kaʻina i hoʻopaʻa ʻia a hoʻopaʻa ʻia me kahi ʻimi ʻokoʻa (ʻo ia hoʻi, ka hana duplex PCR).Hoʻohana pinepine ʻia nā mana kūloko e kāpae i nā hoʻonui i hāʻule ʻole, e like me ka wā i ʻike ʻole ʻia ai ke kaʻina pahuhopu.
Laʻana Calibration
He laʻana kuhikuhi (no ka laʻana, ka RNA i hoʻomaʻemaʻe ʻia mai ka laina kelepona a i ʻole ka ʻiʻo) i hoʻohana ʻia i ka helu pili e hoʻohālikelike i nā laʻana ʻē aʻe a pau e hoʻoholo ai i ka pae hōʻike pili o kahi gene.ʻO ka laʻana calibration hiki ke lilo i kekahi laʻana, akā ʻo ka mea maʻamau he mana (no ka laʻana, kahi laʻana i mālama ʻole ʻia a i ʻole kahi laʻana mai ka manawa ʻole o ka hoʻokolohua).

Nā mana maikaʻi
hoʻohana i nā pane hoʻomalu meʻike ʻia ka nui o ka template.Hoʻohana pinepine ʻia nā mana maikaʻi e nānā i ka hana pono ʻana o kahi set primer a i ʻole ka hoʻonohonoho mua-probe a ua hoʻonohonoho pono ʻia ka pane.

ʻAʻohe Mana Mana Manaʻo (NTC)
He hopena hoʻomalu i loaʻa nā mea pono a pau o ka hoʻonui hoʻonui ʻana koe ke kumu hoʻohālike, i hoʻololi pinepine ʻia me ka wai.Hiki i ka hoʻohana ʻana i ka NTC ke loaʻa i ka contamination i hana ʻia e ka reagent contamination a i ʻole DNA haole, pēlā e hōʻoia ai i ka ʻoiaʻiʻo a me ka hilinaʻi o ka ʻike ʻike.ʻO ka hoʻonui ʻana i ka mana NTC e hōʻike ana i ka haumia.

ʻAʻohe mana RT (NRT)
Loaʻa paha i ke kaʻina hoʻoneʻe RNA ke koena genomic DNA, he mea ʻino loa ia a ʻo ia ka mea hewa e pili ana i ka maikaʻi o ka ʻikepili a me ka ʻenemi kūlohelohe o qPCR, no laila i ka wā e hoʻolālā ai i nā hoʻokolohua, pono e hoʻolālā ʻia e hoʻonui wale i ka ʻike RNA.ʻElua ala, ʻo ka hoʻolālā ʻana i nā primers ma waena o nā introns, ʻo ka mea ʻē aʻe e hoʻopau loa i ka DNA, ʻoi aku ka maikaʻi, e kūkākūkā ʻia ma hope.ʻO ka mana NTR he aniani kilokilo e ʻike ai i ka pollution DNA.Inā loaʻa ka amplification, ʻo ia hoʻi, aia ka pollution.

Nā kūlana
ʻO nā maʻamau nā laʻana o ka ʻike ʻike a i ʻole ka helu kope i hoʻohana ʻia no ke kūkulu ʻana i kahi pihi maʻamau.I mea e hōʻoiaʻiʻo ai i ka paʻa o ka maʻamau, hoʻohana pinepine ʻia ka ʻāpana gene i loko o ka plasmid a hoʻohana ʻia ma ke ʻano maʻamau.

ʻO ke kāʻei maʻamau
e hoʻoheheʻe ʻia i loko o ka liʻiliʻi o 5 mau gradients hoʻonaʻauao me ka huahana maʻamau e like me ka pālua pālua, a ua huki ʻia nā helu 5 i nā hoʻonohonoho o ka waiwai CT a me ka helu kope, a ua hoʻopili ʻia nā kiko e hana i kahi laina e hoʻohua ai i kahi pihi maʻamau.No kēlā me kēia pihi maʻamau, pono e nānā ʻia kona kūpono.Hāʻule ka waiwai slope ma waena o -3.3 a me -3.8, a ua hana ʻia kēlā me kēia ʻano ʻekolu.Pono e hoʻolei ʻia nā kiko i ʻokoʻa loa mai nā wahi ʻē aʻe.Lawe ʻia ka waiwai CT o ka hāpana e hoʻāʻo ʻia i loko o ka pihi maʻamau, a hiki ke helu ʻia ka pae hōʻike o ka hāpana e hoʻāʻo ʻia.

Lawe ʻia ka waiwai CT o ka hāpana e hoʻāʻo ʻia i loko o ka pihi maʻamau, a hiki ke helu ʻia ka helu kope mua o ka hāpana e hoʻāʻo ʻia.

Ka pono a me ka Slope
Hōʻike ka slope o ka pihi maʻamau i ka pono o ka PCR manawa maoli.
· ʻO kahi piʻi o -3.322 e hōʻike ana he 1, a i ʻole 100% ka maikaʻi o ka PCR amplification, a pālua ka nui o ka huahana PCR i kēlā me kēia pōʻai.
· ʻO kahi piʻi liʻiliʻi ma lalo o -3.322 (e laʻa, -3.8) e hōʻike ana i ka pono PCR
· ʻO kahi piʻi i ʻoi aku ma mua o –3.322 (e laʻa, -3.0) e hōʻike ana ua ʻoi aku ka maikaʻi o ka PCR ma mua o 100%, ʻo ia hoʻi, pehea e hiki ai i hoʻokahi pōʻaiapuni o PCR ke hoʻonui i ka ʻoi aku ma mua o ka pālua o ka huahana i hoʻonui ʻia?Loaʻa kēia kūlana i ka pae laina ʻole o ka hopena PCR, ʻo ia hoʻi, aia ka nui o ka hoʻonui ʻole kikoʻī.

kahe hoohehee
Ma hope o ka pau ʻana o ka hoʻonui ʻana i ka qPCR, ua wela ka huahana PCR.Ke piʻi aʻe ka mahana, hoʻoheheʻe mālie ʻia ka huahana hoʻonui ʻelua-stranded, e hopena i ka emi ʻana o ka ikaika fluorescence.Ke loaʻa kahi mahana (Tm), e heheʻe ka nui o nā huahana.Hāʻule ka fluorescence.Loaʻa i nā huahana PCR ʻokoʻa nā waiwai Tm a me nā wela hoʻoheheʻe ʻokoʻa, i ʻike ʻia ke kikoʻī o ka PCR.

Pipi hehee (pue derivative)
Hoʻokumu ʻia ka pihi hoʻoheheʻe e hana i kahi palapala kiʻekiʻe, hiki ke hōʻike maʻalahi i ke kūlana o nā ʻāpana huahana PCR.No ka mea, ʻo ka wela hoʻoheheʻe ʻana ka waiwai Tm o ka ʻāpana DNA, hiki ke hoʻoholo ʻia kekahi mau ʻāpana e pili ana i ka waiwai Tm o ka ʻāpana DNA, e like me ka nui o ka ʻāpana, ka ʻikepili GC, a pēlā aku.ʻO ka lōʻihi o ka huahana i hoʻonui ʻia aia ma ka laulā o 80-300bp, no laila pono ka mahana hoʻoheheʻe ma waena o 80 ° C a me 90 ° C.

ʻO ka wehewehe ʻana i ka pōʻai heheʻe: Inā ʻike ʻia ka piko nui wale nō ma waena o 80°C-90°C, ʻo ia hoʻi, ua kūpono ka PCR quantitative fluorescent;inā ʻike ʻia ka piko nui ma waena o 80°C-90°C a ʻike ʻia nā piko like ʻole ma lalo o 80°C, e noʻonoʻo ʻia ka dimer primer.Hiki iā ʻoe ke hoʻāʻo e hoʻonui i ka mahana annealing e hoʻoponopono ai;inā ʻike ʻia ka piko nui ma waena o 80°C-90°C, a ʻike hou ʻia ka piko like ʻole i ka wā e piʻi ai ka mahana, ua manaʻo maoli ʻia aia he DNA contamination, a pono e wehe ʻia ka DNA ma ka pae mua o ka hoʻokolohua.

ʻOiaʻiʻo, aia kekahi mau ʻano ʻano ʻino, e wāwahi ʻia kēlā me kēia ma lalo.
3. ʻIke holomua

No ka hana qPCR, pono wau e ʻōlelo MIQE,ʻIke liʻiliʻino ka hoolaha ana oKa nuiPCR manawa maoliNā hoʻokolohua - ka ʻike liʻiliʻi no ka hoʻopuka ʻana i nā ʻatikala e pili ana i ka PCR quantitative manawa maolinā hoʻokolohua .I mea e maʻalahi ai ka ʻike o kēlā me kēia, e hoʻomaʻamaʻa mākou i ka ʻike kī.

Hiki iā ʻoe ke ʻimi i ka kikokikona mua o MIQE ma ka Pūnaewele, a ʻo ka mea nui loa, ʻo ia ke kuhikuhi i kapapa helu helu ʻikepili e pono e hāʻawi ʻia i ka wā e paʻi ana i kahi ʻatikala .

Hiki i nā mea nānā ke hoʻoholo i ka maikaʻi o ka hoʻokolohua ma ka heluhelu ʻana i kēia mau kikoʻī;Hiki i nā mea heluhelu e hiki mai ana ke hoʻohana i kēia e hana hou a hoʻomaikaʻi paha i ka hoʻokolohua.
Pono e hoʻomaopopo ʻia ma kēia papa inoa, ua kaha ʻia ke koʻikoʻi o kēlā me kēia papa inoa me E a D paha.He aha ka manaʻo?E: ʻike pono (pono e waiho ʻia);D: ʻike makemake ʻia (e hāʻawi i ka mea hiki).

MIQE (1)—Hoʻolālā Hoʻokolohua
ʻAʻole ʻike ka nui o ka poʻe scumbags i hoʻopau i kā lākou pale ʻana ma hope o ka pau ʻana o kā lākou haʻawina puka i ka hoʻolālā kūʻokoʻa, wehe i kā lākou mau puke, a hana i ka mea a ke kumu e ʻōlelo ai iā lākou e hana.ʻO ka hopena, ʻaʻole i koʻikoʻi ka hoʻolālā hoʻokolohua, a ua ʻōlelo ke keʻena hoʻoponopono o ka makasina e makemake lākou e hana i kēia kiʻi a me kēlā kiʻi, no laila ua hana lākou me ka makaʻu.ʻO kēia ke ʻano o ka hana ʻia ʻana o nā scumbags!

Ma kahi kokoke i ka home, ʻo ke kumu mua o ka hoʻokolohua e hoʻoholoka oolea o ka manao hoao.ʻO ka mea nui loa, ʻo ia ka hoʻolālā hoʻokolohua, a ʻo ka mea nui loa e pili ana i ka hoʻolālā hoʻokolohua ʻo ia ke hoʻonohonoho ʻana i ka laʻana i manaʻo ʻia, ka hāpana kuhikuhi (mana), a me ka helu o nā repetitions, i hiki ke kuhikuhi ʻia ka ʻikepili hoʻokolohua, hoʻohālikelike, a hoʻomaopopo.

ʻO ka laʻana pahuhopue pili ana i ka laʻana e koi ana iā mākou e ʻike i ka gene i hoʻopaʻa ʻia ma hope o kekahi lapaʻau.ʻO ka laʻana kuhikuhiʻO ia ka laʻana me ka ʻole o ka lāʻau lapaʻau, i ʻōlelo pinepine ʻia he ʻano hihiu i ka biology.

Hoʻopiʻi hoʻokolohuahe mea nui loa.ʻO ka maʻamau, ʻoi aku ka nui o nā hoʻopiʻi hoʻohuli ʻana ma mua o ʻekolu.Pono e hoʻokaʻawale i ke ʻano o ka replication biological a me ka replication ʻenehana.

Nā Hoʻopiʻi Ola: ʻO ka hoʻokolohua hōʻoia like i hana ʻia me nā mea like ʻole (ka manawa, nā mea kanu, nā pūʻulu, nā pā pane).

ʻO ka hoʻololi ʻana i ke ola
E lawe kākou i ka lāʻau pesticide o ka pepa i laʻana.Makemake mākou e pīpī i nā lāʻau pesticides ma luna o nā mea kanu ʻekolu o ABC, a laila ʻo nā mea kanu ʻekolu o ABC he ʻekolu hoʻopiʻi olaola, a ʻo ia ka hoʻokolohua hōʻoia like i hana ʻia me nā mea like ʻole.Akā, ma ke ʻano he hoʻokolohua, pono pono ka mana, no laila hiki iā mākou ke pīpī i kekahi o nā lālā o ka mea kanu A e hana i kahi hui hoʻokolohua o ka mea kanu A, a ʻaʻole e pīpī i nā lālā ʻē aʻe o ka mea kanu A e hana i kahi pūʻulu mana.E hana like no B a me C.

Hoʻopiʻi ʻenehana (Hoʻopiʻi ʻenehana): He hoʻokolohua hou ia i hoʻolālā ʻia e pale i nā hewa i hana ʻia e ka hana, ʻo ia hoʻi he lua lua i hoʻokomo ʻia i loko o ka mea like.Pono nā lāʻau lapaʻau a me nā hoʻomalu e hoʻopili hou i nā hoʻonohonoho (ka liʻiliʻi ʻekolu) o ka gene target a me ka gene reference.

Hoʻopuka hou ʻenehana
E lawe hou i ka pepa i mālama ʻia me nā pesticides.No ka pūʻulu hoʻokolohua o ka mea kanu A, ua hana mākou i ʻekolu puka PCR o 1, 2, a me 3 no kāna gene i hoʻopaʻa ʻia a me ka moʻo kuhikuhi kūloko, no laila e lawe i ka awelika ma hope o ka ʻike ʻana.No ka mālama ʻana i ka mea kanu A ua mālama ʻia nā hui ma ke ʻano like.Pēlā nō, e hana like no nā mea kanu B a me C.He hana hou ʻenehana kēia.

Pono e hoʻomaopopo i kēlāʻO ka mea i komo i loko o ka helu helu, ʻo ia ka hoʻopiʻi biological, a ʻo ka hana ʻenehana e hoʻāʻo ai inā aia kekahi mau hanana maʻamau i loko o ke kaʻina hoʻokolohua, i mea e hilinaʻi ai nā hopena hoʻokolohua, ʻo ia hoʻi, e pale i nā hewa ma ka lawe ʻana i kā lākou awelika e like me kā mākou e ʻōlelo pinepine ai.

Nā Mana Kūʻē—NTC a me NRT
NTC (Ka Mana Mana Manaʻo ʻole), hoʻohana ʻia ka mana me ka hoʻohālikelike ʻole, e hōʻoia inā ua haumia ka mea hoʻokolohua.ʻO ka maʻamau, hoʻohana ʻia ka wai ma ke ʻano he laʻana.Inā loaʻa kahi hopena fluorescent, hōʻike ia ua hiki ke hoʻohaumia i ka waika nucleic i loko o ka hale hana.

No loko mai o kēia mau pollution: ka wai haumia, nā reagents kūpono ʻole i loaʻa i ka DNA endogenous, pollution primer, pollution lako hale hana, pollution aerosol, etc., pono e hoʻohana i ka RNase scavengers a me RNase inhibitors.ʻO ka pollution aerosol ka mea paʻakikī loa e loaʻa.E noʻonoʻo ʻoe ua like kāu keʻena hana me ka smog, me nā ʻakika nucleic like ʻole i hoʻokuʻu ʻia i ka lewa.

NRT (No-Reverse Transcriptase), ka mana me ka hoʻohuli ʻole ʻana, ʻo ia ka RNA i hoʻopaʻa ʻole ʻia ma ke ʻano he mana maikaʻi ʻole, ʻo ia ka mana o ke koena gDNA.

I ka hana ʻana i ka hōʻike gene, ʻike ʻia ka nui o ka RNA ma ka ʻike ʻana i ka nui o cDNA ma hope o ka hoʻohuli ʻana.Inā loaʻa ke koena gDNA i ka wā e hoʻomaʻemaʻe ʻia ai ka RNA, e hana hewa ia i nā hopena hoʻokolohua, no ka mea, ʻo nā hopena maoli i loaʻa he gDNA a me cDNA.Ma ka pae aggregate, ʻaʻole cDNA wale nō, pono e hoʻopau loa ʻia ka gDNA i ka wā o ka unuhi ʻana o RNA.

MIQE (2)—ʻike laʻana
ʻO ka ʻike i kapa ʻia he laʻana, ʻo ia hoʻi ke paʻi mākou i kahi ʻatikala e pili ana i ka qPCR, pono mākou e wehewehe pono i ka ʻike hōʻike, he ʻāpana koʻikoʻi o ka ʻatikala.Pēlā nō, ke hana mākou i nā laʻana, pono mākou e hoʻoponopono i kā mākou mau hana ponoʻī e hōʻoia i ka pono o nā laʻana.

ʻO ka wehewehe ʻana o ka laʻana he hopena wale nō, a pono mākou e nānā nui i nā mea i lawe ʻia i ka wā o ka hoʻokolohua holoʻokoʻa.

Ke koho ʻana i nā mea hoʻokolohua
Nā hōʻailona koko - koho i ke koko hou, ʻaʻole ʻoi aku ma mua o 4 mau hola.Nā hōʻailona pūnaewele - koho e hōʻiliʻili i nā pūnaewele hou i ka wā o ka ulu ikaika.ʻAi holoholona—E koho i ka ʻiʻo e ulu ikaika ana.Mea kanu - E koho i ka ʻiʻo ʻōpiopio hou.

Ua ʻike paha ʻoe aia kahi huaʻōlelo nui i kēia mau ʻōlelo liʻiliʻi: hou .
No nā laʻana i luna, ʻo ka pahu maikaʻi loa, kumukūʻai, a paʻa i ka mākeke ʻo Foregene's kit, hiki ke wehe a maʻalahi i kā lākou DNA a me RNA.

Koko DNA Mini Kit

Kelepona Huina RNA Isolation Kit

Huina Hoʻokaʻawale RNA Holoholona

Mea Kanu Huina RNA Isolation Kit

Mea Hoʻohui RNA Isolation Kit Plus

Mea hoʻokaʻawale DNA mea kanu

Ka mālama ʻana i nā mea hoʻokolohua
ʻO ka ʻōlelo maʻamau, ʻaʻole mākou e paipai e mālama i nā laʻana, inā ʻae nā kūlana.Eia nō naʻe, nui nā hoaaloha ʻaʻole hiki ke hana i nā hoʻokolohua ma hope koke o ka laʻana, a pono kekahi e lawe i nā pahu wai nitrogen wai i ke kula no ka laʻana.

No kēia ʻano hoa paʻakikī, hiki iaʻu ke ʻōlelo wale ʻaʻole maopopo ʻoe i nā mea hoʻohana reagent.I kēia manawa, nui nā ʻoihana hoʻohana reagent e hana i nā reagents e hiki ke mālama i nā laʻana RNA i ka lumi wela, a hiki iā ʻoe ke koho e hoʻohana iā lākou.ʻO ke ʻano mālama mālama maʻamau, ʻo ia ka mālama ʻana i ka nitrogen wai, me ka hoʻohana ʻana i kahi pahu wai nitrogen liʻiliʻi e maʻalahi ke lawe.Ma hope o ka hoʻihoʻi ʻana i ka hāpana i ka hale hana, e mālama iā ia i loko o kahi -80°C pahu hau.

No nā hoʻokolohua e pili ana i ka RNA, pono e hahai ʻia ka ʻōlelo kumu ʻeono:haʻahaʻa wela, ʻaʻohe enzymes,awikiwiki .

He maʻalahi ka manaʻo o ka haʻahaʻa haʻahaʻa;me ka ʻole o nā enzymes, aia ʻo RNase ma nā wahi āpau o ka honua a mākou e noho nei (inā ʻaʻole ua pepehi ʻia ʻoe e ka maʻi HIV), no laila pehea e pale aku ai iā RNase i ka wā e hana ai i nā hoʻokolohua he manaʻo nui loa;wikiwiki,ʻAʻohe Kung Fu ma ka honua hiki ʻole ke haki, ʻaʻole hiki ke haki ka wikiwiki.

No laila, ma ke ʻano, ʻoi aku ka pōkole o ka manawa unuhi, ʻoi aku ka maikaʻi o ka pahu.No ke ahaForegeneʻO kā kit e hoʻokūpaʻa i ka wikiwiki, no ka mea, ʻike pono lākou.

PS: Hana maikaʻi kekahi mau kaikamahine i nā hoʻokolohua, akā ʻaʻole maikaʻi lākou e like me ka slam dunk ma hope o kekahi mau makahiki o ka hana.Manaʻo lākou he hewa ʻole ke Akua, ʻōhumu no kekahi, a ke ʻimi nei i ke ola.ʻOiaʻiʻo, ʻaʻole maopopo iā ia.ʻAʻole ʻo ia i pale maikaʻi i ka RNA, a maʻalahi ka mea pāʻani slam dunk.I kāna hana ʻana i ka hoʻokolohua, manaʻo ʻo ia e hoʻopau ʻo ia i ka slam dunk me ʻekolu manawa, ʻelima a me ʻelua mahele, akā ua hana maikaʻi ʻo ia i ka hoʻokolohua.

Nānā: ʻOi aku ka lohi, ʻoi aku ka nui o ka hoʻouka ʻana o RNase.Pehea e aʻo ai iā ʻoe iho e wikiwiki?ʻAʻohe ala, hoʻomaʻamaʻa hou aku.

No nā hoʻokolohua like ʻole a me nā laʻana like ʻole, pono nō e heluhelu hou i nā palapala a koho i kahi ala kūpono no ka hana ʻana.No ka laʻana o ka hōʻiliʻili ʻana a me ka mālama ʻana, koi ʻo MIQE e kākau maopopo ʻia i loko o ka pepa, i hiki i ka poʻe loiloi ke nānā i ka hilinaʻi o ka pepa, a he mea maʻalahi hoʻi i nā ʻōpio haʻalulu e hana hou i kāu hoʻokolohua.

ʻOiai paʻakikī nā hoʻokolohua olaola, he kiʻekiʻe lākou.Inā ʻaʻole ʻoe makaʻala, hiki iā ʻoe ke hoʻohuli i ka honua.No ka laʻana, e hoʻolilo iā SARS i kahi pilikia biochemical, a i ʻole ka hana ʻana i ka laiki hybrid e hoʻopakele i 1.3 biliona kānaka.ʻO ke kiʻi ma lalo nei he hoʻokolohua kemika, pono ʻoe e hoʻomaopopo i kou haʻaheo no kāu noiʻi ʻana ma ka nānā ʻana i kona helehelena me he dick.Poina ia, mai ʻeleʻele iā ia.

MIQE (3) - kaʻiʻo nucleic acid.
He hanana nui ka lawe ʻana i ka waika nucleic, a hoʻomaka nā hoʻokolohua molecular biology a pau me ka unuhi ʻana i ka waikawa nucleic.ʻO ka mea mua, e kope kāua i ka ʻike a MIQE ma ka unuhi ʻana i ka waikawa nucleic.

Ke nānā nei i kēia palapala, ʻaʻole hiki iā ʻoe ke noho ma ka ʻili.ʻO ke ʻano he dogma.No ka lilo ʻana i haumāna kiʻekiʻe, pono ʻoe e nīnau i ke kumu.ʻO ka maʻiʻo koʻikoʻi o kēia papa ʻaina: E alualuka maʻemaʻe, ka pololei, ka kūlike, a me ka nui o ka unuhi ʻana o RNA .

ʻO ka hapa mua o kaʻO ke kaʻina hana a i ʻole ka mea hana ʻo ia ka ʻanuʻu ʻokiʻoki nucleic acid.Inā hoʻohana ʻoe i ka mea hoʻoheheʻe nucleic acid no ka unuhi ʻana (mua, e ʻoluʻolu e kelepona mai iaʻu no ke kūʻai ʻana), pono ʻoe e hōʻike i ka inoa hoʻohālike o ka mea kani.

Ka inoa o ka pahu a me

he aha ka pahu i hoʻohana ʻia no nā kikoʻī hoʻololi, he aha nā reagents kūikawā i hoʻohui ʻia a i ʻole nā ​​hana kūikawā i hana ʻia e wehewehe pono ʻia i hiki i nā poʻe ke hana hou i kāu hoʻokolohua.

Hoʻohui kekahi poʻe i kekahi mau reagents kūikawā i ka wā e unuhi ai i nā laʻana kūikawā, me ka manaʻo ʻo kā lākou mea kaua huna kēia a ʻaʻole e haʻi i nā poʻe ʻē aʻe.ʻOiai e hūnā ana, nalowale lākou i ka manawa e hoʻomālamalama i kāu ʻatikala.Mai akamai ʻoe, pono ʻoe e ʻoi aku ka ʻoiaʻiʻo ma mua o ka ʻāina kahiko ʻo Zhang i ka noiʻi ʻepekema, inā makemake ʻoe e akamai, na ka ʻatikala e hana naʻaupō ʻoe.

pono e hoʻomanaʻo i ka helu huahana o ka pahuke kauoha ʻoe i ka pahu a kākau i ka ʻatikala.ʻElua mau helu ma ke kit: Cat—helu helu helu (helu huahana, helu ʻatikala), Lot—helu ʻāpana huahana (Hoʻohana ʻia e hōʻike i ka pūʻulu i hele mai ai ka huahana).

Eia kekahi, hoʻohana pinepine ʻia ka helu CAS i ke kauoha ʻana i nā reagents biochemical, a e hoʻolaha pū wau iā ia.ʻO ka helu CAS ka helu i hāʻawi ʻia e ka American Chemical Society i kēlā me kēia lāʻau kemika hou.ʻO ka maʻamau, hoʻopili ʻia nā helu ʻekolu e kahi kaha.Ka helu CAS o Rushui: 7732-18-5.He nui nā inoa inoa o nā kemika, akā ʻokoʻa ka helu CAS.Ke kauoha ʻana i ka lāʻau lapaʻau, hiki iā ʻoe ke nānā mua i kāna helu CAS.

Ma kahi kokoke i ka home, no ke aha mākou e wehewehe pono ai i kēia mau mea?ʻOiaʻiʻo, ʻo ia hoʻi e nānā i ka maikaʻi o ka unuhi ʻana o RNA.ʻO ka hoʻohana ʻana i nā mea kani a me nā kits e hoʻohālikelike ʻia ka unuhi ʻana o RNA.ʻAʻole nui ka pālākiō unuhi o nā laboratories maʻamau, a hiki ke loaʻa me nā kits.

Nā kikoʻī o ka mālama ʻana iā DNase a i ʻole RNase
ʻO ka hihia koʻikoʻi o ka fluorescent quantitative PCR ʻo ia ka pale ʻana i ka DNA contamination, a mai hoʻokolohua inā loaʻa ka contamination.No laila, pono e haʻi i ke kaʻina hana āu i hoʻohana ai no ka hoʻoponopono ʻana i ka DNA, i mea e hōʻike ai ua pau a wehe loa ʻia ka DNA i ka hana hoʻokolohua.hōʻike ʻia e kahi kiʻi schematic.

Hoʻolālā kiʻi o RNA a me DNA
Ma keʻano laulā, ʻo ke ala no ka wehe ʻana i ka DNA ʻo ka mālama ʻana i ka RNA me DNase ma hope o ka unuhi ʻana.Eia naʻe, he mau hana kahiko kēia.Ua hiki i nā pahu hōʻiliʻili RNA kālepa ke wehe i ka DNA i ka wā o ke kaʻina hana me ka hoʻohui ʻole ʻana i ka DNase.No ka laʻana, he pūʻulu kits mai Foregene.

Nānā: ʻO ka wehe ʻana i ka DNA i ka wā o ka unuhi ʻana o RNA he pahi kaua makalua weliweli loa, e hoʻolōʻihi i ka manawa hana o ka unuhi ʻana o RNA a hoʻonui i ka pilikia o ka hōʻino ʻana o RNA.ʻO ke kumu, he kālepa ia ma waena o ka hua RNA a me ka maʻemaʻe.

Eia kekahi, ʻo ka nui o ka DNase i hoʻohui ʻia i ke kolamu adsorption silica-based he liʻiliʻi loa, a pono e hoʻohana ʻia ka DNase kiʻekiʻe e hoʻokō i ka hopena.ʻAʻole hiki ke hoʻopau koke ʻia ka DNase unoptimized.He ho'āʻo kēia o ka pae ʻenehana o ka mea kālepa.ʻOiaʻiʻo, ʻoi aku ka nui o nā mea kālepa ʻē aʻe e kaena nei e hiki ke wehe ʻia ka DNA me ka ʻole o DNase.Hiki ke ʻōlelo ʻia ʻo ka mea e haʻaheo e hiki ke hoʻopau loa ʻia ka DNA me ka ʻole o DNase he hooligan.ʻO ka DNA he ʻano paʻa paʻa paʻa ʻelua, ʻaʻole hiki ke holoi ʻia ma ke kamaʻilio ʻana a me ka ʻakaʻaka.

Ka helu hoʻohaumia
ʻano loiloi: ʻike electrophoresis, 1% agarose, 6V/cm, 15min, hoʻouka 1-3 ul

Nucleic acid quantitative analysis
ana maʻamau me ka UV spectrophotometer.E ʻae mai iaʻu e hoʻolaha mua i ke ʻano o nā waiwai ʻekolu o OD260, OD280, a me OD230.
·OD260nm: ʻO ia ka lōʻihi hawewe absorption o ke kiʻekiʻe absorption peak o ka nucleic acid, a ʻo ka helu maikaʻi loa i ana ʻia mai 0.1 a 1.0.Inā ʻaʻole, e hoʻoheheʻe a hoʻopaʻa i ka hāpana e lawe mai i loko o ka laulā.
·OD280nm: ʻO ia ka nalu hawewe absorption o ka piko absorption kiʻekiʻe loa o ka protein a me nā mea phenolic.
·OD230nm: ʻO ia ka lōʻihi hawewe absorption o ke kiʻekiʻe absorption peak o nā carbohydrates.

A laila, e kamaʻilio kākou e pili ana i ke kuleana o kēlā me kēia hōʻailona.No ka A260, hiki ke hoʻohana ʻia e ana i ka hua o ka waikawa nucleic.Ke OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

No ka maʻemaʻe, pono mākou e nānā i nā lakio a mākou e ʻike maʻamau ai: OD260/280 a me OD260/230.
· DNA maʻemaʻe: OD260/280 ua like ia me 1.8.Ke ʻoi aku ka nui ma mua o 1.9, hōʻike ia aia ka pollution RNA, a i ka emi ʻana ma mua o 1.6, hōʻike ia aia ka pollution protein a me ka phenol.
· RNA maʻemaʻe: 1.7
·OD260/230: Inā he DNA a i ʻole RNA, ʻo 2.5 ka waiwai kuhikuhi.Ke emi iho ma lalo o 2.0, hōʻike ʻia aia ka haumia o ke kō, ka paʻakai a me nā mea ola.

RNA pono

He mea nui e ana i ka pono o RNA.ʻO ka maʻamau, pono e hana i kahi hoʻokolohua RNA denaturation gel e nānā inā he pilina ʻelua ka ʻōlinolino ma waena o 28S a me 18S RNA.Ke ʻike ʻia ke kolu o ka hui 5S, ʻo ia hoʻi, ua hoʻomaka ka RNA e hoʻohaʻahaʻa, koe wale nō nā invertebrates.

ʻIke no ka loiloi maikaʻi RNA: Ma waho aʻe o nā hoʻokolohua ma luna, aia kekahi mau hoʻokolohua ʻoi aku ka maikaʻi e pili ana i ka pono RNA, e like me ka hoʻāʻo pono RQI o ka ʻōnaehana electrophoresis aunoa Experion, hiki ke ʻike inā hoʻohaʻahaʻa ʻia ka RNA me ka ʻike ʻole.

Ma ka noiʻi ʻepekema, ʻo ka fluorescent quantitative PCR ka hoʻohālikelike ʻana ma waena o ka gene i manaʻo ʻia a me ka gene reference internal.No laila, i ke kaʻina o ka mālama ʻana i ka laʻana RNA, ka unuhi ʻana o RNA, a me nā mea ʻē aʻe, ʻo ka pahuhopu mua ka hōʻoia i ka pono o ka RNA.

Hiki ke hoʻomaopopo maʻalahi ke ʻano o ka pono o ka RNA i ke kaulike ma waena o ka gene i hoʻopaʻa ʻia a me ka gene reference i loko.ʻO ka hoʻohaʻahaʻaʻana e alakaʻi i ka pauʻole o ka gene, ināʻo ka pihaʻole o ka gene reference gene a iʻole ka pihaʻole o ka gene i hoʻopaʻaʻia, e loaʻa ka hopena nui i kaʻikepili.

ʻAʻole pono e ʻoiaʻiʻo ke kiʻi kiʻi kiʻi o ka gene target a me ka gene reference

ʻO ka hoʻāʻo hoʻopaʻa ʻana (inā i kāohi ʻia ka waiwai CT ma lalo o ke kiʻekiʻe a i ʻole ka haʻahaʻa haʻahaʻa a i ʻole nā ​​kūlana ʻē aʻe)

Ma ka lawe ʻana i kēia kiʻi ma ke ʻano he laʻana, ʻo nā waiwai Ct o nā ʻāpana ʻelima e like me kēia.ʻAʻole kūlike ka māhele ʻana o nā koina CT ma waena o nā pihi, a ua hoʻopaneʻe ʻia nā koina Ct ma lalo o nā haʻahaʻa kiʻekiʻe a me nā haʻahaʻa haʻahaʻa, ʻo ia ka hihia o ka PCR inhibition.

Manaʻo nui: I ke kaʻina o ka unuhi ʻana o RNA, pono mākou e haʻalele i nā kuhi hewa a hoʻokumu i nā mea kūpono.

ʻO ka manaʻo hewa: ʻo ka unuhi ʻana o RNA e ʻimi wale i ka hua, me ka manaʻo ʻoi aku ka nui o ka nui o ka RNA i loaʻa, ʻoi aku ka maikaʻi.ʻOiaʻiʻo, ke hana mākou i ka quantification, inā ʻaʻole nui ka helu o nā genes, ʻaʻole pono mākou i ka RNA nui.ʻOi aku ka nui o ka RNA āu e unuhi ai.

ʻO ka manaʻo kūpono:Pono ka unuhi ʻana o RNA i ka maʻemaʻe, ka pololei a me ka paʻa.Hiki i ka hoʻomaʻemaʻe ke hōʻoia ʻaʻole i kāohi ʻia ka transcription hope a ʻaʻole e hoʻopilikia ʻia ka ʻikepili e DNA.Mālama ka Integrity i ke kaulike o nā kaʻina pahuhopu a me nā kuhikuhi kūloko.ʻO ke kūlike e hōʻoia i ka hoʻouka ʻana i ka hāpana paʻa.

MIQE (4) - hoʻohuli i ka palapala
kuhi hewa: ka imi ana i ka leo hoailona kiekie.
Manaʻo pololei: E ʻimi i ka paʻa (kūpaʻa), me ka nānā ʻole i ka nui o ka RNA i hoʻouka ʻia, e mau ana ka maikaʻi o ka hoʻohuli ʻana i ka transcription, e hōʻoiaʻiʻo i nā ʻokoʻa o ka cDNA hiki ke hōʻike maoli i nā ʻokoʻa i ka mRNA.
Wehewehe mākou i kēia kaʻina hana me kahi kiʻi schematic:

ʻAʻole ʻoiaʻiʻo ke kiʻikuhi o ka hoʻololi ʻana i ka pono
ʻO ka mea mua, pono mākou e hoʻomaopopo i ka ʻokoʻa ma waena o ke kaʻina transcription reverse a me ke kaʻina PCR.Loaʻa ka PCR i nā kaʻina hana hoʻomehana a me ka annealing, a ua ulu nui ka ʻāpana pahuhopu;ʻoiai ʻaʻole i loaʻa kēia kaʻina hana hoʻohuli, hiki iā mākou ke noʻonoʻo he hoʻokahi-a-hoʻokahi ka hoʻololi ʻana I ka wā o ke kaʻina hana, e like me ka nui o nā ʻāpana RNA.

no ka mea hiki ke loaʻa i nā ʻāpana cDNA Information, pono e hoʻomaopopo ʻia i kēia manawa, no ka mea, ua hoʻohuli ʻia nā ʻāpana nui a me nā liʻiliʻi, a ʻaʻole hiki ke nānā aku i kahi ʻāpana.A no ka liʻiliʻi o ka nui o ka RNA, he liʻiliʻi ka nui o ka cDNA i loaʻa, ʻaʻole like me PCR, he hopena hoʻonui, no laila hiki ʻole ke ʻike.

nā hopena electrophoresis cDNA
ʻO ka lua, ʻoi aku ka maikaʻi, hana ʻia ka hoʻohuli ʻana i hoʻokahi, akā ʻaʻole hiki i ka transcriptase hoʻohuli mai kekahi hui ke hoʻokō i kēia hopena.ʻO ke kumu, hele ka maikaʻi o ka hapa nui o nā transcriptases ma waena o 30-50%.Inā ʻo ia ka hihia, ʻoi aku ka maikaʻi o ka hoʻololi ʻana i ka hoʻololi ʻana, ʻo ia ka mea a mākou e makemake ai e ʻike i ke kiʻi: 3 RNA e loaʻa i 2 cDNA, 6 RNA e loaʻa i 4 cDNA, no laila ʻaʻohe mea e pili ana i ka nui o ka hāpana i hoʻouka ʻia, ʻoi aku ka paʻa o ka hoʻololi ʻana.ʻAʻole makemake mākou e ʻike i ke kūlana i paʻa ʻole ai ka maikaʻi o ka hoʻololi ʻana i ka unuhi ʻana a ua kāohi ʻia ka manaʻo kiʻekiʻe.

No laila, pehea e hōʻoia ai inā paʻa ka maikaʻi o ka unuhi ʻana?He mea maʻalahi loa ke ʻano, pono ʻoe e hana i kahi hoʻohālikelike hoʻohālikelike: ʻo kekahi e hoʻohuli i ka transcribe i loko o ka cDNA ma hope o ka pālua ʻana i ka dilution o RNA, a ʻo ka mea ʻē aʻe e hana pālua i ka dilution ma hope o ka hoʻohuli ʻana i ka cDNA, a laila e hana qPCR e ʻike i ka slope i loaʻa.Ma ke ʻano he haumāna kiʻekiʻe, pono ʻoe e hoʻomaopopo iā ia i kekona.E like me ka mea i hōʻike ʻia ma lalo nei:

ʻO ka hoʻoheheʻe ʻana o RNA a me cDNA e hoʻāʻo ai inā paʻa ka maikaʻi o ka transcription hoʻohuli
Reverse transcriptase a me ka pahu
Pehea e hiki ai i ka PCR fluorescent quantitative maikaʻi ke loaʻa i ka reverse transcriptase a me ka kit.Hoʻokaʻawale ʻia ʻo Reverse transcriptase i ʻelua ʻano e like me ke kumu, AMV a i ʻoleM-MLV, a ua like ka lakou hana me ka mea i hoikeia ma ka papa.

RNase H hana
ʻO RNase H ʻo Ribonuclease H, ʻo ka inoa Kina ʻo ribonuclease H, he endoribonuclease hiki ke hoʻokahe pono i ka RNA ma ke kaulahao hybrid DNA-RNA.ʻAʻole hiki iā RNase H ke hoʻokahe i nā mea paʻa phosphodiester i ka DNA a i ʻole RNA i hoʻokahi-stranded a i ʻole RNA, ʻo ia hoʻi, ʻaʻole hiki iā ia ke hoʻoheheʻe i ka DNA a i ʻole RNA i hoʻokahi.Hoʻohana maʻamau i ka synthesis o ke kaula lua o cDNA.

He mea kupanaha.Ke ʻōlelo nei mākou he hana RNase H ka reverse transcriptase, ʻaʻole ʻo ka reverse transcriptase i loaʻa iā RNase H, a ʻaʻole hiki ke hoʻokaʻawale i ka RNase H mai ka reverse transcriptase, ma muli paha o ka conformation o kekahi mau pūʻulu i ka reverse transcriptase Ua hana ʻia kēia hana e ka reverse transcriptase.

No laila, me ka nānā ʻole i ke kiʻekiʻe kiʻekiʻe o ka hoʻololi ʻana o ka AMV, ʻo kāna hana RNase H e hōʻemi i ka hua o cDNA.ʻOiaʻiʻo, ke hoʻomau mau nei nā mea hana reagent i kā lākou huahana e hoʻopau i ka hana RNase H i ka transcriptase reverse e like me ka hiki ke hoʻonui i ka hua o cDNA.
ʻO ka mahana anaaling

ʻO ka hana lua o RNA ma nā wela like ʻole
E ʻike i ke kiʻi ma luna no ke kūkulu lua o RNA ma nā wela like ʻole, a e hoʻohana i ka mFold mea paahana pūnaewele e hoʻoholo ai i ke ʻano lua o ka ʻāpana i hoʻopaʻa ʻia ma lalo o nā kūlana wela a me ka paʻakai.Ma ka 55 ° C, paʻakikī loa ka hana lua o ka RNA, ʻaʻole hiki ke hoʻohana i ka transcriptase hoʻohuli, a ʻaʻole hiki ke hoʻoholo piha ʻia ke ʻano lua a hiki i 65 ° C, ʻoiai ʻoi aku ka haʻahaʻa o ka mahana maikaʻi loa o AMV a me M-MLV ma mua o kēia mahana.
he aha ka hana?ʻO ka papa hana lua ka hoʻohui pū ʻana o ka template ponoʻī, e alakaʻi ana i ka hoʻokūkū ikaika ma waena o ka primer a me ka reverse transcriptase a me ka template, ka hopena o nā pilikia e like me ka haʻahaʻa E a me ka maikaʻi ʻole.

he aha ka hana?E hoʻonui wale i ka mahana annealing e like me ka hiki.

Ke hoʻomaikaʻi nei ka nui o nā mea hana reagent i kā lākou reverse transcriptase ma o ka genetic engineering.Hoʻonui kekahi i ka wela o ka hopena, e like me Jifan a me Aidelai, a wehe kekahi i ka pūʻulu ikaika o RNase H enzyme e hoʻomaikaʻi i ka pilina ma waena o ka enzyme a me ka template RNA.Hiki i ka pilina kiʻekiʻe ke hoʻopaʻapaʻa i ka papa hana lua a heluhelu maʻalahi, a hoʻomaikaʻi maikaʻi hoʻi i ka pono o ka transcription hoʻohuli.
ʻO ke kumu nui: ʻOi aku ka mea nui o ka hoʻihoʻi ʻana i ka hoʻopaʻa ʻana i ka pono o ka hoʻololi ʻana i ka hana (ʻaʻole pono nā enzyme e ʻoi aku ka maikaʻi akā paʻa nō hoʻi), ma mua o ka nui o ka laʻana i hoʻouka ʻia, inā ʻaʻole ia he PCR quantitative fluorescent nui, ʻaʻole hiki loa.Nui nā cDNA.
Ua hana pū kekahi mau mea hana like ʻole i ka ʻimi ʻana i ka kūlike.No ka laʻana, ua hoʻopili ka hapa nui o nā ʻoihana i ka transcription hoʻohuli ma ke ʻano he kit maʻamau no ke kūʻai aku, ʻo ia kahi koho maikaʻi.
No ka laʻana, ʻo nā kits RT Easy Series a Foregene:

RT Easy I (Master premix no ke kaula mua cDNA synthesis kit)

MIQE (5) - ʻike ʻike gene

Ke wehewehe nei ka helu maluna
1. Hiki ke hōʻoia ʻia ma o nā hoʻokolohua pinepine ʻia paha kēia ʻano.
2. Gene ID, ʻike ʻoe.
3. ʻO ka lōʻihi o Gene, ʻaʻohe pilikia ka lōʻihi o ka gene i manaʻo ʻia.I ka hoʻolālā ʻana i nā primers, e hōʻoia i ka lōʻihi o ka amplicon ma waena o 80-200bp e hōʻoia i ka maikaʻi o ka hoʻonui ʻana.
4. Sequence Blast hoʻohālikelike ʻike, pono e hoʻohālikelike ʻia ka gene i hoʻopaʻa ʻia i loko o ka genebank e pale ai i ka hoʻonui ʻole.
5. Loaʻa i nā pseudogenes.ʻO kahi pseudogene he kaʻina DNA e like me ka gene maʻamau akā nalowale kāna hana maʻamau.Loaʻa pinepine ia i ka ʻohana multi-gene o eukaryotes.Hōʻike pinepine ʻia e ψ.He kope DNA genomic non-functional i loko o ka genome i like loa me ka coding gene sequence., ʻaʻole i kākau ʻia, a ʻaʻohe manaʻo physiological maopopo.
6. Ke kūlana o nā kumu mua e pili ana i nā exons a me nā introns.I nā makahiki mua, i ka wā i hoʻoponopono ai mākou i ka pilikia o ka hoʻohaumia ʻana o DNA, ua nānā pinepine mākou i nā kūlana o nā primers, exons, a me introns, a noʻonoʻo maʻamau e hoʻolālā i nā primers ma waena o nā introns e pale i ka hoʻonui ʻana o DNA.E ʻoluʻolu e ʻike i ke kiʻi ma lalo nei: ʻeleʻele e hōʻike ana i nā introns, ʻo nā ʻulaʻula like ʻole e hōʻike ana i nā exons, ʻo ka ʻulaʻula e hōʻike ana i nā kumu mua maʻamau, a ʻo ka ʻulaʻula ʻulaʻula e hōʻike ana i nā kumu mua o ka intron-spanning.

Schematic, ʻaʻole ʻoiaʻiʻo
He hoʻolālā maikaʻi loa kēia i manaʻo ʻia, akā ʻo ka ʻoiaʻiʻo, i ka hapanui o nā hihia, ʻaʻole like nā mea hoʻokalakupua trans-intron e like me ka mea i manaʻo ʻia, a e hoʻoulu pū lākou i ka hoʻonui ʻole.No laila, ʻo ke ala maikaʻi loa e pale aku ai i ka hoʻohaumia ʻana i ka DNA ʻo ka wehe ʻana i ka DNA.
7. Ka wanana conformation.Me ka hoʻohana hou ʻana i kēia laʻana, e hoʻohana i ka mea hana pūnaewele mFold no ka hoʻoholo ʻana i ke ʻano lua o ka ʻāpana i hoʻopaʻa ʻia ma kahi wela a me ka paʻakai paʻakai.

ʻO ka hana lua o RNA ma nā wela like ʻole
ʻO ka hoʻolālā lua ka hoʻohui pū ʻana o ka template ponoʻī, kahi e alakaʻi ai i ka hoʻokūkū ikaika ma waena o ka hui mua a me ka hoʻohālikelike ʻana, a ʻoi aku ka liʻiliʻi o nā manawa o ka hoʻopaʻa mua ʻana, e hopena i nā pilikia e like me ka haʻahaʻa E a me ka maikaʻi ʻole.Ma o ka wānana polokalamu, inā ʻaʻohe pilikia o ke kūkulu lua, maikaʻi ia.Inā loaʻa, e kūkākūkā kā mākou ʻatikala e pili ana i ka hoʻoponopono ʻana i kēia pilikia.

MIQE (6)—qPCR Oligonucleotides

No ka PCR fluorescent quantitative, ʻo ka mea mua āu e hakakā nei i kēlā me kēia lā, ʻo ia ka RNA extraction, a ʻo ka lua paha ka hoʻolālā mua.
ʻO ka mea mua, nānā mākou i nā lula e pili ana i ka hoʻolālā mua e like me ka papa helu MIQE.He mea maʻalahi loa ia e ʻakaʻaka ai nā scumbags, a hiki iā mākou ke hoʻopau iā ia i hoʻokahi ʻōlelo: e ʻike i ke kaʻina a me ke kūlana o ka ʻimi mua a me ke ʻano hoʻololi.No ke ʻano hoʻomaʻemaʻe mua, ʻoi aku ka liʻiliʻi o ka synthesis primer i kēia manawa, kūpono ka qPCR i ka PAGE a ma luna o nā ʻano hoʻomaʻemaʻe, a ʻaʻole nui ka ʻike o ka mea hana synthesis.Nui nā poʻe i hana i nā primers no nā makahiki he ʻumi a ʻaʻole ʻike ʻo ka synthesizer ʻo ABI3900.
E pili ana i nā loina o ka hoʻolālā kumu, ʻaʻole pono ʻoe e hoʻopaʻanaʻau iā lākou ma ka rote, no ka mea hiki i ka hapa nui o ka polokalamu hoʻolālā hoʻolālā a i ʻole nā ​​​​mea hana pūnaewele ke mālama i kēia mau pilikia (manaʻo ʻia ka mea hana pūnaewele primer3.ut.ee/), a ʻaʻole hana lima ʻia ka 99.999% o ka hoʻolālā primer E nānā, hoʻolālā ka mea kākau i kekahi manawa i nā haneli o nā primers i ka lā, inā heluhelu ʻoe i kēlā me kēia, e lilo ia i cross-eyed.
E nānā wale i nā helu ma hope o ka hoʻolālā ʻana o nā primers:
1. Hoʻolālā i nā kumu mua kokoke i ka hopena 3': I ka hihia o ka hoʻohana ʻana i nā oligo dT primers no ka cDNA first-strand synthesis, me ka noʻonoʻo ʻana i ka maikaʻi o ka transcription reverse a me ka pono RNA, pono e hoʻolālā ʻia nā primers i hoʻolālā ʻia kokoke i ka hopena 3' e hoʻomaikaʻi ai i ka pono amplification.E hoʻohana i ke kiʻi e wehewehe penei (ʻaʻohe ala e hoʻomaopopo ai i kēia):

No ke aha e hoʻolālā ʻia ai nā primers kokoke i ka hopena 3′, ʻaʻole pono ia
2. Waiwai TM: Aia ka waiwai Tm ma 55-65 ° C (no ka mea, ʻo ka hana exonuclease ka mea kiʻekiʻe loa ma 60 ° C), a ʻo ka ʻike GC ma 40% -60%.
3. BLAST: I mea e pale aku ai i ka hoʻonui ʻole o ka genome, pono e hoʻohana ʻia ʻo Blast no ka hōʻoia hou.

MIQE(7)—ka hana qPCR

1. pahu qPCR
E like me nā koi o MIQE, pono mākou e wehewehe pono i nā kūlana hopena piha i ka ʻatikala, me ka hoʻonohonoho ʻana o ka ʻōnaehana hopena PCR, he aha ka pahu i hoʻohana ʻia, ʻo wai ka mea hana, pehea ka nui o ka ʻōnaehana pane, inā hoʻohana ʻia ke ʻano dye a i ʻole ke ʻano probe, nā hoʻonohonoho polokalamu PCR.E ʻike maoli nā mea hoʻokele kahiko i ka wā i koho ʻia ai ka pahu, ua hoʻoholo maoli ʻia ka ʻike ma luna.
I kēia manawa, ʻo ka hana ʻana a me ka hana ʻana i nā kits PCR fluorescent quantitative he ʻenehana makua loa.ʻOiai ʻaʻole ʻoe e koho i nā mea hana ʻino loa, ʻaʻole kiʻekiʻe ka nui o nā pilikia, akā makemake mākou e kaʻana like me ʻoe i kekahi mau mea:
Hoʻomaka wela Taq enzyme:ʻO ka hapa nui o ka PCR ʻo ia ka hoʻomaka wela Taq enzyme.Hoʻokaʻawale ʻia nā enzyme hoʻomaka wela ma ka mākeke i ʻelua mau ʻano, ʻo kekahi he enzyme hoʻomaka wela i hoʻololi ʻia (hiki iā ʻoe ke noʻonoʻo iā ia he paraffin embedding), a ʻo ka mea ʻē aʻe he enzyme hoʻomaka wela no ka hoʻololi antibody (antigen-antibody binding).ʻO ka hoʻololi kemika kahi ala mua o nā enzymes hoʻomaka wela.Ke hiki i kahi mahana, e hoʻokuʻu ka enzyme i kāna hana.Hoʻohana ka enzyme hoʻomaka wela i hoʻololi ʻia e ka antibody i nā ala olaola e pale ai i ka hana o ka enzyme.Ke hiki i kahi mahana, e hoʻopau ʻia ka antibody a hoʻopau ʻia ma ke ʻano he protein, a e hoʻokō ʻia ka hana enzyme.

Eia naʻe, he aha ka hoʻohana ʻana o kēia?ʻO kēia ka hihia, ʻoi aku ka wikiwiki o ka hoʻokuʻu ʻana o nā enzymes i hoʻololi ʻia i ka antibody ma mua o nā enzyme i hoʻololi ʻia, no laila ma ke ʻano o ka naʻau, loaʻa iki nā enzyme i hoʻololi ʻia i ka antibody, no laila ʻaʻohe mea i hoʻololi ʻia kemika i nā kits ma ka mākeke.Inā aia, a laila paʻa mau ka ʻenehana o kēia mea hana i ke au o ka millennium.
ʻO ka hoʻopaʻa ʻana o ka magnesium ion:He mea koʻikoʻi ka manaʻo o ka magnesium ion i ka hopena PCR.Hiki ke hoʻoikaika i ka hoʻokuʻu ʻana o ka hana enzyme Taq i ka ʻike ʻana o ka magnesium ion.Inā haʻahaʻa loa ka manaʻo, e hoʻemi nui ʻia ka hana enzyme;inā kiʻekiʻe loa ka manaʻo, e hoʻonui ʻia ka hoʻonui ʻana i ka enzyme-catalyzed non-specific amplification.E pili pū ana ka neʻe ʻana o nā ion magnesium i ka annealing o nā primers, ka wela hoʻoheheʻe o ka template a me nā huahana PCR, a laila e hoʻopili ai i ka hua o nā ʻāpana i hoʻonui ʻia.Hoʻomalu ʻia ka neʻe ʻana o nā ion magnesium ma 25mM.ʻOiaʻiʻo, no kahi pahu maikaʻi, pono e hoʻomalu maikaʻi ʻia ka ʻike o nā ion magnesium.Hoʻohui kekahi mau mea kālepa i kahi mea hoʻoheheʻe magnesium ion i ka reagent, hiki ke hoʻokō i ka hopena o ka hoʻoponopono maʻalahi o ka neʻe ʻana o ka magnesium ion.
ʻO ka hoʻopaʻa ʻana o ka wai kala fluorescent:ʻO ka dye fluorescent, ʻo ia ka SYBR Green a mākou e hoʻohana maʻamau ai, e hana nui i ka fluorescence ma o ka hoʻopaʻa ʻana i ke awāwa liʻiliʻi o ka DNA kaulua, no ka mea, ʻaʻole kikoʻī ka hoʻopaʻa ʻana o ka wai i ka DNA kaula ʻelua, ʻo ia hoʻi, ʻoiai e hui pū ʻia ka DNA kaulua me ia, hiki i ka fluorescence ke hana i kahi hōʻailona DNA, no laila hiki ke hoʻohui ʻia ka fluorescence i loko o ka ʻōnaehana kumu.
PS: Ma muli o kāna mau waiwai māmā, hoʻopili ʻia nā huahana ma ka mākeke i loko o nā paipu centrifuge opaque brown (e like me ka hōʻike ʻana ma ke kiʻi ma lalo).Eia naʻe, e loaʻa ana kēia pilikia.He mea paʻakikī ke ʻike inā ua omo ka wai i ka wā e laʻa ai.Ma kēia ʻano, ʻo Qingke ka mea hoʻohana maikaʻi loa (e like me ka mea i hōʻike ʻia ma ke kiʻi ma lalo nei), a ua hoʻopili ʻia ka paipu alohilohi i loko o kahi ʻeke tin opaque.A laila e hoʻokomo i loko o kahi ʻeke tin, e noʻonoʻo i ka ʻoluʻolu o ka pale ʻana i ka māmā a me ka laʻana.Pono ʻoe e koho i ka helu huahana kūpono.ʻO TSE204 kahi ola maikaʻi loa, kahi e makemake ai au e kanu i ka mauʻu.

He mea koʻikoʻi nō hoʻi ka neʻe ʻana o ka wai kala fluorescent.Inā haʻahaʻa loa ka manaʻo, ʻaʻole e piʻi ka pihi hoʻonui i ka pae hope a ʻaʻole kūpono;inā kiʻekiʻe ka ʻike, e hoʻopilikia ʻia ka walaʻau.Ma muli o ka nui o ka PCR fluorescent quantitative i ka waiwai CT, inā ʻaʻole i hoʻoponopono pono ʻia ka neʻe ʻana o ka wai kala fluorescent, ʻoi aku ka maikaʻi o ka helu haʻahaʻa ma mua o ke kiʻekiʻe.ʻOiaʻiʻo, ʻoi aku ka maikaʻi o ka hoʻopaʻa ʻana i ke kala kūpono.

ROX: Hoʻohana ʻia nā wai waihoʻoluʻu ROX e hoʻoponopono i nā hewa hōʻailona fluorescence maikaʻi.Pono kekahi mau mea hana i ka calibration, aʻo nā mea ʻē aʻe ʻaʻole.No ka laʻana, pono maʻamau ka hoʻohana ʻana o Thermo Fisher Scientific's Real Time PCR amplification instrument, me 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, etc.
Loaʻa i ka Foregene's qPCR Mix ka ROX dye, kahi kūpono no ka hoʻohana ʻana i nā ʻano like ʻole.

ʻO ka manawa maoli PCR Kit-Taqman

Nawaliwali ka hoʻopaʻa paʻa hydrogen: ʻO ka mālama ʻana i nā paʻa hydrogen nāwaliwali kahi mea ʻenehana.ʻAʻohe mea i heluhelu i nā manual o nā pahu he nui, akā ʻaʻohe o lākou i haʻi i kēia kumuhana.ʻOiaʻiʻo, he mea nui loa ia.ʻO ka hui pū ʻana o nā kumu ma muli o ka ikaika o nā paʻa hydrogen.ʻO nā paʻa hydrogen ikaika ka hoʻonui maʻamau, a ʻo nā paʻa hydrogen nāwaliwali ke alakaʻi i ka hoʻonui ʻole.Inā ʻaʻole hiki ke hoʻopau maikaʻi ʻia nā paʻa hydrogen nāwaliwali, ʻaʻole hiki ke pale ʻia ka hoʻonui ʻole ʻana.I loko o ke kiko o ka mea kākau, he kakaikahi wale nō nā hui i ʻike i kēia pilikia.Ke kūʻai ʻoe i ka pahu, hiki iā ʻoe ke nānā inā ua noʻonoʻo ʻoe i kahi hopena ma kēia ʻano no ka pahu āu e makemake ai e koho.

Ka nui o ka pane: Hoʻohana pinepine ʻia ka ʻōnaehana 20-50ul, a ʻoi aku ka liʻiliʻi o nā puke liʻiliʻi i nā hewa.Ma ka ʻōlelo maʻamau, e ʻōlelo ʻia nā ʻōlelo aʻoaʻo kit i ka hoʻohana ʻana i ka nui o ka hopena PCR.Mai noʻonoʻo a hoʻohana i nā puke liʻiliʻi e mālama i nā kumukūʻai.ka pahuhopu o.Ua hoʻāʻo maoli ʻia ka leo i ʻōlelo ʻia e nā mea kālepa, a ʻaʻole hiki iā lākou ke hoʻoponopono i ka pilikia o nā hewa i hana ʻia e nā puke liʻiliʻi.
2. ʻO ka mea hana a me ka helu ʻatikala o ka pā paipu
Ua ʻike nā kānaka a pau i ke kumu o ka fluorescent quantitative PCR.Lawe ʻia ka hōʻiliʻili ʻana o ka fluorescence ma o nā pāpale paipu PCR.Ke koho ʻana i nā mea hoʻohana PCR, e hoʻolohe i nā helu ʻelua: ka lawe māmā maikaʻi a kūpono i ka mea kani.ʻO ka ʻōlelo maʻamau, maikaʻi nā papa a me nā paipu o nā mana nui, akā pono ʻoe e koho pono e pili ana i ka hoʻololi ʻana, inā ʻaʻole hiki iā ʻoe ke hoʻohana i ka mea kani.

4. ʻIke pae kiʻekiʻe

MIQE (8)—hōʻoia qPCR
ʻO kēia ka mea nui o ka qPCR!Nui nā koa i hāʻule i ke one ma ʻaneʻi.ʻOiaʻiʻo, laki paha ʻoe a maʻalahi nā genes āu i aʻo ai, no laila ua lana ʻoe ma ke ana hau ma ka makani.ʻO ka ʻike hōʻoia o qPCR i manaʻo ʻia e hoʻāʻo i ka hilinaʻi o ka ʻikepili.Hoʻopaʻa inoa mākou i ka ʻike hōʻoia pono e like me kēia:

1.Specificity ho'āʻo
Hoʻāʻo ʻia ka kikoʻī o ka hoʻonui ʻia ʻana o ka gene ma ka nānā ʻana inā he hui hoʻokahi ke kiʻi electrophoresis;hōʻoia hoʻonohonoho ʻana;ka ʻaʻe heheʻe e ʻike inā he hoʻokahi ka palapala kiʻekiʻe;ka hōʻoia ʻana o ka enzyme digestion a me nā ʻano hana ʻē aʻe.
Maʻaneʻi, nānā mākou i ka tka nānā 'ana i ka ho'onui 'ole me ka ho'ohana 'ana i ke ala o ka ho'ohehe'e 'ana.ʻO ka mea maʻamau, i ka wā e hoʻolālā ai mākou i nā primers, pono ka nui o ka ʻāpana huahana ma ka laulā o 80-200bp, ka mea e hoʻoheheʻe ai ka wela o ka huahana PCR 80-85 °C.No laila, inā he mau piko like ʻole, pono e loaʻa nā huahana hoʻonui ʻole kikoʻī;inā ʻike ʻia ka piko ma lalo o 80°C, ua manaʻo ʻia he dimer primer;inā ʻike ʻia ka piko ma luna o 85°C, ua manaʻo ʻia ʻo ia ka DNA contamination a i ʻole ka hoʻonui Nonspecific o nā ʻāpana nui.
'Ōlelo Aʻo: I kekahi manawa aia hoʻokahi wale nō piko ma 80°C.I kēia manawa, pono e mālama i kēia manaʻo.ʻO nā hualoaʻa hoʻonui paha he mau dimer mua.

ʻĀpana hoʻoheheʻe maʻamau (ka piko hoʻokahi me ka hoʻonui ʻole kikoʻī)

ʻĀpana hoʻoheheʻe pilikia (ka hoʻonui kikoʻī ʻole o nā piko hoʻopunipuni)
【Ka helu helu】

Aia kahi piko nui, akā koʻikoʻi ka dimer primer
Hiki ke hoʻopunipuni maʻalahi i kou mau maka i ka piko hehee hoʻokahi, me ka manaʻo he hoʻokolohua kūpono loa ia, akā hewa loa ka hopena.I kēia manawa, pono mākou e nānā i ka wela hoʻoheheʻe.Aia ka wela kiʻekiʻe ma lalo o 80 ° C, ʻo ia ka primer-dimer.

ʻAʻohe ʻāpana pahuhopu, nā dimer mua a pau
Eia, ʻaʻole hiki i koʻu kaikunāne ke hoʻōki.ʻO ke kiʻi ma lalo nei he kiʻi i paʻi ʻia me ke kelepona paʻa i hoʻouna ʻia mai iaʻu e kahi scumbag.ʻO nā reagents āna i hoʻohana ai he mau hōʻailona maʻamau ia i ka ʻoihana.Ua hoʻololi ʻo ia mai kahi hōʻailona T-prefix a i kahi hōʻailona T-prefix ʻē aʻe.Manaʻo wau ua kuhi mua ʻoe.Ua uē mai ka scumbag iaʻu: “Ua maikaʻi loa ka reagent i hoʻohana ʻia ma ke kiʻi mua, a hoʻokahi ka piko.Ma hope, ma hope o ka hoʻohana ʻana i ka reagent āu i ʻōlelo ai, e like ia me ke kiʻi ʻelua, me nā piko hui.Ua hoopilikia mai oe ia'u.“
E hoʻokaʻawale i nā pakuhi ʻelua.I ka nānā mua ʻana, he piko hoʻokahi ko kekahi, a he piko pālua kekahi.Nonsense, hoʻokahi peak ʻoiaʻiʻo maikaʻi.He oiaio anei?
ʻOi aku ka ʻino ma mua o Dou E, inā wau e kau i nā kiʻi ʻelua ma ke kiʻi ma lalo nei, e hoʻomaopopo koke ʻoe.ʻOiaʻiʻo, maʻalahi mākou i ka lolo e kēia ʻano kiʻi.Ma hope o ka nānā pono ʻana, ua ʻike mākou: ʻo ka piko o ke kiʻi mua ma 75°C, ʻo ia ka dimer primer;ʻike ʻia ka piko o ke kiʻi ʻelua ma 75 ° C a me 82 ° C, ma ka liʻiliʻi loa i ʻike ʻia ka huahana.

Nā kiʻi manaʻo mai nā haumāna
No laila ʻo ka pilikia nui ʻaʻole ka pilikia o nā reagents, akā ʻo ka pilikia o ka hoʻolālā mua.I ka manawa like, ua hōʻike pū ʻia ʻaʻole o ka hao ka maikaʻi o kekahi mau lama nui, a ke hōʻoiaʻiʻo nei hoʻi i ka mea a koʻu kaikunāne i ʻōlelo ai ma mua: ʻAʻole ia ka brand reagent e kākoʻo i kāu ʻatikala.ʻO kāu ʻatikala i kākoʻo i ka brand of reagents.E noʻonoʻo wale, inā ʻaʻole i hoʻololi ka scumbag i nā reagents, e hoʻouna ʻia ka ʻikepili hewa i ka puke pai, a ʻo ka mea e hiki mai ana he pōʻino.
2. Ct waiwai o ka mana hakahaka
Mai wehewehe, inā he waiwai Ct ka mana blank, ʻaʻole anei ia he haumia?Eia nō naʻe, pono ʻoe e hoʻomaopopo i ka mana blank he waiwai Ct.Inā ʻo ia ka NTC, ʻo ia hoʻi, aia kekahi DNA haole e like me ka reagent contamination.Inā ʻo ia ka NRT, ʻo ia hoʻi, ʻo ka RNA i unuhi ʻia he DNA contamination.
3. Pipi maʻamau
Me ka slope a me ka helu helu, hiki ke helu ʻia ka pono PCR ma o ka formula.Pono ka hoʻokolohua kūpono i ka pali o ka pihi maʻamau e hoʻokokoke i 3.32, a me R² e hoʻokokoke i 0.9999.
4. Linear dynamic range
He laina laina ka laulima ikaika o ka pane.E like me ka la'ana i ho'ohana 'ia no ka ho'opuka 'ana i ke ka'e ma'amau, pono e ho'okomo i ka laula ho'oikaika 'ana ma kahi o 5 mau gradient no'ono'o, a e ho'olohe i ka ho'ololi 'ana o nā koina Ct ma nā gradients ki'eki'e.
5. ʻIke pololei
ʻO nā hoʻololi ʻana i nā hopena qPCR, ʻo ia hoʻi, hiki ke hoʻihoʻi maikaʻi ʻole, ʻo ia hoʻi, ʻoi aku ka maikaʻi ʻole, ma muli o nā kumu he nui, e like me ka mahana, ka ʻike, a me ka hana.ʻAʻole hiki ke hoʻomalu ʻia ka pololei qPCR i ka emi ʻana o ka helu kope.ʻO ka hoʻololi ʻana i loko o ka hoʻokolohua kūpono, pono e ʻokoʻa kēia ʻano ʻenehana mai ka hoʻololi olaola, a hiki i nā hoʻopiʻi olaola ke hoʻoponopono pololei i nā ʻokoʻa helu helu ma nā hopena qPCR ma waena o nā hui a i ʻole nā ​​lāʻau lapaʻau.No nā ho'āʻo diagnostic, pono e hōʻike ʻia ka pololei inter-assay maikaʻi loa (reatability) ma nā pūnaewele a me nā mea hana.
6. ʻIke pono a me LOD (ma ka multiplex qPCR)
ʻO LOD ka haʻahaʻa haʻahaʻa o 95% o nā laʻana maikaʻi i ʻike ʻia.I nā huaʻōlelo ʻē aʻe, ʻaʻole pono e ʻoi aku ka nui o ka LOD i loko o kahi hoʻonohonoho o ka hoʻopiʻi ʻana i nā gene i hoʻopaʻa ʻia ma mua o 5% o nā hopena i hāʻule ʻole.I ka hana ʻana i ka loiloi qPCR multiplex, ʻoi aku ka nui o ka ʻike like ʻana o nā mutations a i ʻole polymorphisms, pono e hāʻawi ka multiplex qPCR i nā hōʻike ʻaʻole i hoʻohālikelike ʻia ka pololei o nā ʻāpana pahuhopu he nui i ka paipu hoʻokahi, ka ʻike he nui a me ka ʻike paipu hoʻokahi.ʻOi aku ka nui o ka hoʻonui ʻia ʻana o nā genes target concentration kiʻekiʻe a me nā genes target concentration haʻahaʻa i ka manawa like, pono e nānā ʻia kēia pilikia.
Nā pilikia a me nā hoʻonāʻO ka ʻōlelo maʻamau, ʻo nā pilikia i ʻike pinepine ʻia ma ka qPCR debugging e pili ana i kēia mau ʻaoʻao:
· hoʻonui ʻole
· Paʻakikī ke koho ʻana i ka ʻike kumu mua a me ka pilikia me ka primer-dimer
· ʻAʻole pololei ka mahana annealing
· Hoʻopili ka hana lua i ka pono hoʻonui
hoʻonui nui ʻole
hoʻonui kikoʻī ʻolehiki mai, noʻonoʻo ʻia inā ʻaʻole kūpono ka hoʻolālā kumu, akā inā ʻaʻole ʻoe e wikiwiki e hoʻololi i nā primers, hiki iā ʻoe ke hoʻāʻo i nā ʻano hana mua (ua hoʻopili pū ʻia ke kumumanaʻo):
· E hoʻonui i ka wela o ka annealing - e hoʻāʻo e hana i nā paʻa hydrogen nāwaliwali hiki ʻole ke mālama;
· Hoʻopōkole i ka manawa annealing a me ka hoʻolōʻihi ʻia - e hōʻemi i ka manawa o nā paʻa hydrogen nāwaliwali;
· E ho'ēmi i ka noʻonoʻo mua - e hoʻemi i ka manawa o ka hoʻopaʻa ʻana i nā kumu mua a me nā ʻāpana ʻole i hoʻopaʻa ʻia;
Haʻahaʻa amplification pono
ʻO ke kūlana kūʻē i ka hoʻonui ʻole kikoʻī - ka hoʻonui haʻahaʻa haʻahaʻa, a ʻo nā mea e hana ai i ka pono hoʻonui haʻahaʻa he ʻokoʻa wale nō:
· E hoʻolōʻihi i ka manawa annealing a me ka elongation;
· E hoʻololi i ʻekolu mau ʻanuʻu PCR a hoʻemi i ka mahana annealing;
· Hoʻonui i ka manaʻo kumu mua;
Ps: Nui nā haumāna puka i hānau ʻia i ka makahiki 90 ʻaʻole makemake e aʻo pehea e debug i nā hoʻokolohua, a manaʻolana e hiki i ka pahu ke hoʻopau loa i ka pilikia (inā makemake ʻoe e hele i kahi hui reagent e hana i ka noiʻi a me ka hoʻomohala ʻana ma hope o ka puka ʻana), ʻoiaʻiʻo, ua noʻonoʻo nā mea hana reagent i kēia ʻano, manaʻo wau he naʻaupō hiki ke hoʻohana ʻia i ka wā e loaʻa ai, no laila, ua hoʻohana ʻia ka reagent i ka pilikia, no laila ua hoʻopau nā mea hana reagent. nawaliwali H-bode absorption kumu.No ka hoʻoponopono maʻalahi i ka pilikia, pono ka poʻe naʻaupō e heluhelu i ka hoʻolauna ʻana o ka hui reagent e ʻike inā aia kekahi kumu e komo ai i nā paʻa hydrogen nāwaliwali.
ʻO ke koho paʻakikī o ka noʻonoʻo mua a me ka pilikia me nā primer-dimer
Hanana 1: Ma ka ʻōlelo maʻamau, ua ʻōlelo ʻia nā ʻōlelo aʻoaʻo kit no qPCR i nā ʻōnaehana a i ʻōlelo ʻia i nā manaʻo kumu mua.
Hana 2: Debugging ma ka hoʻonohonoho ʻana i ka gradient kumu.Ua ʻaihue ʻia ke kiʻi ma lalo mai kahi hui e hōʻike ai.Hōʻike ka kiʻi ma lalo nei i nā hopena quantitative fluorescence i hana ʻia me ʻekolu mau kaha kiʻekiʻe kumu mua (100nM, 250nM, 500nM) a me ʻehā mau ʻanuʻu kumu hoʻohālikelike (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Kuhi ʻia ka waiwai Ct o nā hopena hoʻokolohua penei:

Koho ʻia ʻo Primer Concentration E hoʻohui i kēlā me kēia kumu kumu i kahi laina penei:

ʻOi aku ka maikaʻi o ke koho ʻana o ke kumu kumu, ʻoi aku ka maikaʻi o ka pilina laina o ka 100nM a me 250nM, a ʻoi aku ka maikaʻi o ka pilina laina o ka 500nM.Ma 100nM a me 250nM, he liʻiliʻi ka waiwai Ct o 250nM, no laila ʻo 250nM ka manaʻo kumu mua.Hiki ke ʻike ʻia nā dimer-dimer koʻikoʻi ma ke kaʻe heheʻe.He aha inā ʻaʻole hiki i nā primera i hoʻolālā ʻia ke pale i nā primer-dimer?
Hanana 3: E ho'ēmi i ka nui o nā primers a hoʻonui i ka annealing wela (ʻaʻole pono e wehewehe).
ʻO ka waiwai empirical o ka mahana annealing he 60 ° C.Inā ʻaʻole maopopo ʻoe, pehea e koho ai i kahi mahana annealing kūpono?Ua like ka pane me ke koho ʻana i ka manaʻo kumu mua -hōʻike gradient.E kiʻi i kahi kiʻi mai ka hui Bio-rad e hōʻike i ka pilikia.No ka hoʻonui ʻana i kekahi ʻāpana pahuhopu, e hoʻonoho i ʻewalu mau ʻanuʻu wela, kēlā me kēia me ʻekolu hana hou ʻana, a ʻo ka pihi hoʻonui i loaʻa penei:

koho wela annealing:
· 70°C, 69°C—Ma ke kumu, ʻaʻole hiki ke hoʻohui ʻia nā primers, no laila ʻaʻohe hoʻonui.
· 67.3 ° C - He wahi liʻiliʻi ka hoʻonui ʻana i ka hoʻomaka, a ʻoi aku ka nui o ka waiwai Ct.
·64.5°C——Ke emi nei ka waiwai Ct.
· Ma 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, a me 55.0°C, ua paʻa nā kumu waiwai Ct, akā ʻokoʻa nā koina fluorescence hope loa.
Pehea e koho ai?Kumu: ʻO ke kumu mua ka waiwai Ct kiʻekiʻe.No ka waiwai like Ct, koho i ka wela annealing kiʻekiʻe e pale aku i ka dimerization a me ka hoʻonui ʻole.ʻOiai aia ka waiwai fluorescence kiʻekiʻe ma 55 ° C, aia paha nā dimer a i ʻole ka hoʻonui ʻole ʻana i loko.
Akā inā he akamai ʻoe e like me ʻoe, e noʻonoʻo maoli ʻoe: ʻO ka ʻōlelo kūpono, inā kikoʻī loa ka hopena o ka PCR, ʻoiai ʻoi aku ka nui o ka manaʻo kumu ma mua o ka palena haʻahaʻa, ʻaʻohe hopena o nā wahi kiʻekiʻe a me nā haʻahaʻa, e like me nā dyes fluorescent a me nā dNTP.ʻOiaʻiʻo, ʻoiai e hoʻopaʻa pono ʻia ka mahana annealing, e hōʻemi maoli ʻia ka hopena o ka ʻike kumu mua ma ka waiwai Ct.

Hoʻopaʻa pono ʻia ka mahana annealing, a e hoʻemi ʻia ka hopena o ka manaʻo kumu mua ma CT
Hoʻopili ka hana ʻelua i ka pono hoʻonui
E kiʻi kākou i ke kiʻi mai Bio-rad e hōʻike i ka pilikia.Hoʻolālā pū ʻo ia i kahi ʻanuʻu wela e hoʻonui i kahi gene me kahi ʻano lua.

Puka mai ka hale lua
Hiki ke ʻike ʻia i ka emi ʻana o ka gradient wela, e hoʻomaka ana nā huahana a neʻe ka waiwai Ct i mua, a hiki i ka waiwai liʻiliʻi ma 60.7 ° C, a laila i ka emi ʻana o ka gradient mahana, ʻoi aku ka nui o ka waiwai Ct.ʻO ka mea ʻē aʻe, i ka piʻi ʻana o ka mahana, wehe ka hale lua a piʻi aʻe ka pono hoʻonui.Ma hope o ka hiki ʻana i kahi mahana, ʻaʻole hiki i ka hoʻonui ʻana i ka mahana ke hoʻomaikaʻi i ka pono amplification.No ka mea ʻaʻole hiki ke hoʻohui pū ʻia nā primers i kēia manawa.No laila,e nānā i ka wela me ka waiwai Ct haʻahaʻa loa, ʻo ia ka mahana maikaʻi loa no ka hoʻonui ʻana i ke kumu hoʻohālike lua!ʻOiaʻiʻo, pono ka poʻe naʻaupō akamai e ʻike inā ʻaʻole pono, ʻoi aku ka maikaʻi o ka hoʻololi ʻana i nā primers a pale i ka ʻāpana o ke kūkulu lua.
5. Ka pae noi
MIQE—Ka Ikepili

Hāʻawi nui ʻia ka ʻikepili ʻikepili e ka mea hana PCR fluorescent quantitative.Ma ka ʻatikala mua, ua hana ʻia ka nui o ka hana ʻikepili, e like me ka mana blank, i wehewehe ʻia i ka hoʻolālā ʻana o ka hoʻokolohua.Ua wehewehe ʻia nā genes kuhikuhi kūloko, helu helu, etc., ma ʻaneʻi mākou e wehewehe nui i ka noi o qPCR.
Hoʻohana nui ʻia ka qPCR, a ʻo ka hōʻoia hoʻokolohua a me ka maʻi nucleic acid ka mea maʻamau i hoʻohana ʻia.
ka helu piha
Loaʻa i ka log (ka hoʻomaka mua) ka pilina laina me ka helu o nā pōʻai.Hiki ke kiʻi ʻia kahi ʻōkuhi maʻamau mai kahi maʻamau me ka helu kope mua i ʻike ʻia, ʻo ia hoʻi, hiki ke loaʻa ka pilina laina o ka hopena hoʻonui.E like me ka waiwai Ct o ka hāpana, hiki ke helu ʻia ka ʻike i ka hāpana.Ka nui o nā mamana e hoʻokomo.

Ke Kaʻina Helu Kuʻuna Loa
Pono e hoʻokumu ʻia ka quantification holoʻokoʻa ma luna o ka pihi maʻamau.No ka hana ʻana i kahi pihi maʻamau, pono kahi maʻamau.ʻO ka maʻamau, ʻo ka maʻamau he plasmid i loaʻa ma ka hoʻopaʻa ʻana i ka gene target.No ke aha he plasmid?No ka mea, ʻo ka DNA plasmid circular ka paʻa loa.E hoʻoheheʻe i ka huahana maʻamau i 5 a 6 mau kaha e like me ka pālua pālua (10-fold dilution), a e hoʻolohe i ka like ʻole i ka wā e hoʻoheheʻe ai.E hāʻule ka waiwai Ct ma waena o 15-30.

Hoʻomākaukau maʻamau
I ka manawa like, pono e hoʻoheheʻe ʻia ka hāpana e hoʻāʻo ʻia e like me ia (e hoʻomanaʻo i ka dilution factor), a e hāʻule pū ka waiwai Ct ma waena o 15-30.Hoʻokomo pū ʻia ka huahana maʻamau + ka laʻana e hoʻāʻo ʻia ma ka mīkini.Ma hope o ka holo ʻana, ua hana ʻia kahi ʻāpana maʻamau me ka mea maʻamau, a ua lawe ʻia nā mea hoʻohālike e hoʻāʻo ʻia i loko o ka pā maʻamau e helu i ka ʻike.
ʻO ka maʻi maʻi Hepatitis B ʻo HBV ka helu maʻamau maʻamau, hiki ke helu i ka helu kope kope ma 1ml o ke koko.
Helu helu kope
E hoʻāʻo ʻia ka ʻike laʻana (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × kumu hoʻoheheʻe
Laʻana molekala kaumaha = helu o nā kumu × 324
ʻO ka helu kope o ka hāpana e hoʻāʻo ʻia (kope/ul) = ka neʻe ʻana o ka hāpana e hoʻāʻo ʻia / ke kaumaha molekala o ka hāpana × 6 × 1014

Ke ʻano helu helu kope

ʻO ka mea i luna ke ʻano helu no ka hoʻoholo ʻana i ka nui.He pilikia makemakika kēia e hiki ke hoʻopau ʻia ma hope o ke puka ʻana mai ke kula kiʻekiʻe, a ʻo nā pilikia makemakika ka mea maʻamau e hoʻoponopono ʻia e nā kamepiula.Inā ʻaʻole maopopo iā ʻoe, hiki iā ʻoe ke hele mai e kamaʻilio.
helu pili
Hoʻohana nui ʻia ka quantification pili i ka noiʻi ʻepekema.ʻEhia mau maʻi maʻi i loko o ka 1ml o ke koko, a he maʻi DNA ia, he hanana hoʻohālikelike kēia: hiki ke hoʻoholo i ka nui o ke koko, a paʻa ka maʻi DNA.Eia naʻe, he mea paʻakikī iā mākou ke hoʻohālikelike i ka helu o nā kope kope o kekahi gene i loko o ka lau, no ka mea paʻakikī ke hoʻoholo i ka nui, ke kaumaha, a me ka palupalu o ka lau, paʻakikī ka nui o ka RNA i unuhi ʻia, a paʻakikī hoʻi ka maikaʻi o ka hoʻololi ʻana, ʻo ia hoʻi, hiki i kēlā me kēia ʻanuʻu ke hana i ka ʻikepili hoʻokolohua i nā pōpoki a ʻaʻole hiki ke hoʻohana ʻia.
No laila, pono e hoʻokomo ka helu pili i kahi mea:ʻo ka gene reference .
I nā huaʻōlelo ʻē aʻe, ʻo ka quantification pili ka hoʻohālikelike ʻana ma waena o ka gene target a me ka gene reference internal.Ke hoʻohālikelike ʻia i loko o ka ʻiʻo like a me ka cell like, ʻoi aku ka liʻiliʻi o ka mana o ka nui o ka laʻana, ka nui o ka unuhi ʻana o RNA, ka hoʻohuli ʻana i ka maikaʻi, a me ka pono PCR.Ma muli o ka liʻiliʻi liʻiliʻi, ua hōʻemi ʻia nā genes kuhikuhi kūloko a me nā genes target.ʻO ia ke kumu i koʻikoʻi ai mākou i ka kūlike a me ke kūpaʻa ma mua.
ʻO nā genes kuhikuhi kūloko ka mea maʻamaunā genes mālama hale( nā genes mālama hale), e pili ana i kahi papa o nā genes i hōʻike paʻa ʻia i loko o nā cell āpau, a pono kā lākou huahana e mālama i nā hana ola kumu o nā cell.
Mai huikau i keia manao.ʻO nā genes mālama hale he mau huaʻōlelo hana olaola, aʻo nā genes kuhikuhi kūloko he mau huaʻōlelo ʻenehana hoʻokolohua.Pono nā genes mālama hale e hāʻawi i ka hōʻoia ma mua o ke koho ʻia ʻana e like me nā genes kuhikuhi kūloko.
No ka laʻana, ua koho mākou i kekahi mau genes mālama hale ma ke kiʻi ma lalo nei e hoʻāʻo ai i ko lākou pae hōʻike i loko o nā pūnaewele kikoo like ʻole, a ʻike mākou he ʻokoʻa loa nā pae hōʻike o β-2-microglobulin mai nā genes ʻē aʻe ʻekolu, no laila ʻaʻole hiki ke hoʻohana ʻia e like me nā genes kuhikuhi kūloko.

Ma hope o ka hoʻomaopopo ʻana i ka hana hoʻoponopono o ka gene reference internal, loaʻa ʻelua algorithm ma muli o ka hoʻokomo ʻana o ka gene reference internal.
· ʻano ʻano ʻāwili maʻamau pālua
· 2 – △△Ct ala (CT value comparison method)
Inā makemake ʻoe i ke aʻo ʻana i nā ʻano a me nā hana gene, e ʻoluʻolu e haʻalele i ka noiʻi ʻana i nā algorithms a hoʻohana pololei i nā formula, a i ʻole e hoʻohana pololei i nā mīkini;inā he kanaka pololei ʻoe ma ka makemakika a me ka ʻenekinia, e ʻoluʻolu e ʻoluʻolu.
ʻano ʻōpuni maʻamau pālua
E hoʻonui i ka gene i hoʻopaʻa ʻia a me ka gene mālama hale o ka hāpana hoʻomalu a me ka hāpana e hoʻāʻo ʻia ma o ka pihi maʻamau, a laila e helu i ka waiwai pili e like me ke kumu helu helu, ʻo ia ka pae hōʻike pili.
Pōmaikaʻi: ka nānā ʻana maʻalahi, ka hoʻokolohua hoʻokolohua maʻalahi
Pono ʻole: No kēlā me kēia gene, pono e hana i kēlā me kēia pōʻai hoʻokolohua i kahi pihi maʻamau
Hoʻohana: ʻO kekahi o nā ʻano hana kuʻuna pili ʻelua i hoʻohana pinepine ʻia a ʻike ʻia i ke aʻo ʻana i ka hoʻoponopono ʻana i ke ʻano gene
Penei ke kumu:

Eia nā laʻana:

E helu i ka huina pili ma muli o ka hopena quantitative
2 – △△Ct keʻano (CT value comparison method)

Pōmaikaʻi: ʻAʻole pono e hana i kahi pihi maʻamau
Nā pōʻino: Ua manaʻo ʻia ua kokoke ka hoʻonui ʻana i ka 100%;ʻo ka hoʻokaʻawale maʻamau he <5%, a ua manaʻo ʻia ka paʻa maʻamau a me ka pono ma waena o kēlā me kēia hoʻonui;ʻoi aku ka paʻakikī o ka hoʻonui ʻana i nā kūlana hoʻokolohua.
Hoʻohana: ʻO kekahi o nā ʻano hana kuʻuna pili ʻelua i hoʻohana pinepine ʻia a ʻike ʻia i ke aʻo ʻana i ka hoʻoponopono ʻana i ke ʻano gene

ʻOiaʻiʻo, ʻaʻole hiki ke kūpono ka hoʻonui ʻana i ka 1. ʻO ke ʻano hoʻoponopono: Inā ʻike mākou he like ka hoʻonui ʻana o ka gene target a me ka gene reference, akā ʻaʻole like ka hoʻonui ʻana me 1, a laila hiki ke hoʻoponopono ʻia ka 2－△△Ct e like me: (1+E )－△△Ct,lification hiki ke hoʻonui ʻia, no ka laʻana, hiki ke hoʻoponopono ʻia ka Ct,l95, no ka laʻana. 1.95－△△Ct
I kēia manawa, ua pau ka ʻike e pili ana i ka fluorescent quantitative PCR.